抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠实验性葡萄膜炎的治疗作用

摘要

目的： 由于对人类葡萄膜炎的研究受诸多因素的限制，所以主要通过动物模型进行广泛的研究。目前有多种葡萄膜炎动物模型用于研究，本文应用大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharide，LPS)对Wistar大鼠进行免疫，建立Wistar大鼠内毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis，EIU)模型，为葡萄膜炎发病机制和免疫治疗的实验研究提供工具。近年来，抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)治疗广泛地应用于一些自身免疫性疾病，并取得令人瞩目的疗效。应用抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(anti-TNF-α monoclonal antibody，抗TNF-α McAb)阻断大鼠体内的TNF-α，评价其对EIU的临床表现和组织学改变的治疗作用，并研究阻断TNF-α后，大鼠血清和眼组织中TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)-6和白细胞介素-10(IL-10)含量的变化，进一步探讨TNF-α、IL-6和IL-10在EIU发病中的作用。 方法： 1．内毒素性葡萄膜炎动物模型的建立：选用Wistar大鼠15只，分为空白对照组(n=3)和实验组(n=12)。将LPS溶于灭菌生理盐水中，使之终浓度为2mg/ml，分别取75μl该溶液注射至实验组Wistar大鼠的双后足垫，每只大鼠的注射总量为300μg；对照组大鼠双后足垫注射等量灭菌生理盐水。密切随访观察，对大鼠发病后的临床表现进行临床评价与记分，并进行组织学分级。 2．抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠实验性葡萄膜炎的治疗作用： (1)另选用Wistar大鼠54只，分为空白对照组(6只)，阳性对照组(EIU组，24只)和抗TNF-α McAb治疗组(24只)三组；每组又平均分为免疫后4小时、24小时和3天三个时相点观察。 (2)EIU组大鼠双后足底部注射LPS免疫诱导EIU，抗TNF-α McAb治疗组大鼠于LPS免疫前半小时按1μg/kg体重尾静脉注射抗TNF-α McAb，空白对照组大鼠双后足垫注射等量灭菌生理盐水。 (3)临床及组织学检查：免疫大鼠后每2小时进行一次裂隙灯显微镜和眼底镜检查，详细记录发病时间及高峰时间，临床表现和评分，炎症消退时间。分别于免疫后4小时、24小时和3天从大鼠内眦静脉丛取血后，处理大鼠，取眼球，一眼取眼内液，并将两只大鼠的眼内液混合，另一眼常规做病理切片，光学显微镜观察并做组织学分级，评价抗TNF-α McAb对EIU的治疗作用；应用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清和眼内液中的TNF-α、IL-6和IL-10含量，探讨TNF-α、IL-6和IL-10在葡萄膜炎发生发展中的可能作用。 3．统计方法：全部数据用平均数士标准差(x±s)表示，用SPSS 11.5统计软件进行分析，统计方法包括相关分析、独立样本t检验、方差齐性检验和F检验。进行F检验后有显著性差异者(p≤0.05)再进行下述检验，各组均数方差具有齐性时，行Least-significant-difference(LSD)检验；各组均数方差不具有齐性时，行Tamhane's T2检验。以p≤0.05作为统计学显著性差异界值。 结果： 在实验组Wistar大鼠中成功地复制出EIU疾病模型，患病率为100％，均出现典型的葡萄膜炎表现；第4小时有10只大鼠出现虹膜血管扩张，少数出现前房闪辉和细胞，之后逐渐加重，于24小时炎症达高峰，出现虹膜纹理模糊、后粘连，瞳孔缩小，前房内纤维蛋白素样渗出，瞳孔膜闭，玻璃体混浊，眼底窥不入。随后这些体征逐渐消退，第7天炎症基本消退。组织学主要表现为前房纤维蛋白及炎性细胞渗出，虹膜血管扩张充血，虹膜肿胀增厚伴有蛋白渗出，前后房及虹膜睫状体基质炎细胞浸润渗出，玻璃体腔内大量炎性细胞聚集。 空白对照组大鼠始终未见有EIU炎症表现；抗TNFα单克隆抗体治疗组Wistar大鼠临床表现明显减轻，平均临床评分及组织学分级显著低于EIU组，发病时间延迟。本实验未发现抗TNF-α抗体治疗组大鼠出现不良反应。 血清和眼内液TNF-α分别为51.03±9.59 pg/ml和26.8pg/ml。在炎症早期EIU组大鼠血清TNF-α浓度(212.76±64.26 pg/ml)明显高于空白对照组，抗TNF-αMcAb治疗组浓度下降至空白对照组水平；EIU组大鼠眼内液TNF-α在4小时、24小时及3天明显高于空白对照组，抗TNF-α McAb治疗组浓度显著下降。空白对照组大鼠血清IL-6浓度为3.23±1.40 pg/ml，眼内液中未检测到IL-6。EIU组血清和眼内液IL-6浓度高于空白对照组，治疗组血清及眼内液IL-6浓度下降，低于EIU组。EIU组血清IL-10浓度在炎症后期提高，治疗组4小时增高更为明显；眼内液IL-10也有增高趋势。眼内液TNF-α在三个不同的时相点均高于血清水平，眼内液IL-10在3天高于血清水平。血清IL-6和眼内液IL-6均与眼部炎症程度有相关性(r=0.777，p<0.01；r=0.678，p<0.01)；眼内液TNF与眼部炎症程度也存在正相关(r=0.607，p<0.01)。血清TNF和IL-6之间，眼内液TNF-α和IL-6之间存在正相关(r=0.551，p<0.05：r=0.452，p<0.05)。 结论：应用LPS成功地在Wistar大鼠体内建立大鼠EIU动物模型。该模型临床表现与人类葡萄膜炎相类似，可用于人类葡萄膜炎的发病机制及免疫治疗等相关研究。该方法简便、稳定、重复性好、发病率高，为进一步研究葡萄膜炎的免疫机制，治疗及预防奠定了实验基础。 抗TNF-α McAb可以有效地治疗EIU，显著改善EIU症状，发病时间延迟。本实验进一步证实了TNF-α和IL-6在EIU的发病中起重要作用。眼内液TNF-α、IL-6和IL-10高于血清中水平，说明眼内自身组织可分泌TNF-α、IL-6和IL-10。IL-10在EIU的病情恢复中起重要的抗炎作用。本实验中抗TNF-α抗体可以完全中和血清中的TNF-α。抗TNF-α McAb治疗可以降低血清及眼组织内TNF-α和IL-6水平，上调血清IL-10浓度，尤其在炎症早期，说明抗TNF-α抗体还可以通过上调IL-10改善炎症病变，促进病情的恢复。抗TNF-α McAb治疗可作为治疗葡萄膜炎的一种有效手段。 本实验还发现血清TNF-α和IL-6之间，眼内液TNF-α和IL-6之间存在正相关，TNF-α增高对IL-6的产生有上调作用，是影响IL-6分泌的因素。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语对照表

声明

前言

第一部分内毒素性葡萄膜炎动物模型的建立

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠内毒素性葡萄膜炎的治疗作用

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 Behcet病与细胞因子的研究进展

在学期间发表论文与参加科研情况

致谢