链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠外周神经病变免疫损伤和环孢素A的抑制作用

摘要

链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠外周神经病变免疫损伤和环孢素A的抑制作用我们近几年在临床上开展的肾活检、皮肤活检和肌肉活检都证明，糖尿病人体内存在广泛的多器官免疫损伤。多年来，糖尿病的防治都是以高血糖为中心的治疗策略，因此糖尿病的慢性并发症的发病机理和临床处理都处于思想茫然和束手无策的尴尬境地。为弄清糖尿病发病机制，更好地从疾病的源头预防和治疗糖尿病及其并发症，作者开展了糖尿病多器官的病理免疫学的研究并尝试用环孢素A进行干预。本实验是整个研究的一部分。 目的：糖尿病外周神经病变(diabetes peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一，神经电生理检查证实90％的糖尿病患者存在DPN。一般认为高血糖是DPN发生的主要原因，氧化应激是糖尿病及其慢性并发症发生的共同环节，然而临床实践证实强化血糖控制未能从根本上阻止DPN的发生与进展。我们的研究工作证实，STZ诱导的糖尿病大鼠存在多器官免疫损伤，活检发现糖尿病患者的肾脏、皮肤和肌肉均存在免疫球蛋白的沉积，因此我们推测糖尿病及其慢性并发症的发生可能是多器官免疫损伤的结果，感染—免疫—炎症—器官损伤—功能障碍是疾病发生和发展的共同规律。 若干研究证实，糖尿病患者血循环中可检测到针对神经系统自身成分的抗体，同时血液中的补体成分显著降低，这些抗体能否造成神经组织的损伤，补体系统的激活是否参与了DPN的发生目前均无定论。核因子-κB(NF-κB)是氧化应激下游启动最早，也是最重要的转录调节因子，是联系氧化应激与炎症反应的枢纽，免疫损伤是否参与了神经组织局部氧化应激的发生，CsA能否抑制氧化应激及下游NF-κB的激活?已经证实，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)参与了糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病的发生，抑制TNF-α在视网膜的表达可延缓糖尿病视网膜病变的进展，CsA能否抑制TNF-α在神经组织的表达尚未见相关报道。 本研究拟从DPN可能存在的免疫损伤入手，以链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠为模型，分别从脊髓、脊髓背根神经节(DRG)和坐骨神经三个部位，评价DPN发生过程中神经组织局部的免疫学异常及其与氧化应激、炎症的关系，观察CsA对DPN的治疗效果，探讨免疫学机制在DPN发病机制中的作用，为临床防治DPN提供一定的依据。 方法：90只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组(CON)、糖尿病组(DM)、低剂量CsA治疗组(ML)、中剂量CsA治疗组(MM)、高剂量CsA治疗组(MH)和胰岛素强化治疗组(MI)。以静脉注射STZ的方法制造糖尿病大鼠模型，成模后ML、MM和MH组分别按照0.5 mg/kg-d、1 mg/kg·d和2 mg/kg·d皮下注射CsA，MI组根据血糖水平给予皮下注射 2-6U/d中效胰岛素，成模16周后处死。留取血、尿标本分别检测肝功能、肾功能、胰岛素、尿蛋白和尿微量白蛋白；观察脊髓、DRG 和坐骨神经形态学变化；采用免疫组化和免疫荧光两种方法评价脊髓、DRG和坐骨神经免疫球蛋白 G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和补体C3b 的表达；测定神经组织丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平；采用免疫组化方法测定上述部位NF-κB 蛋白表达；采用 RT-PCR 和免疫组化方法测定上述部位TNF-αmRNA 和蛋白表达水平。 结果：所有造模大鼠全部成模，实验期间低中高剂量的CsA干预治疗均未造成大鼠肝肾功能损伤。电镜观察发现，16周龄糖尿病大鼠存在坐骨神经髓鞘崩解和轴突萎缩，证实已经发生 DPN。DM 组大鼠轴突/髓鞘面积比值显著低于CON组，中高剂量的CsA和胰岛素治疗均可延缓此种改变，低剂量CsA干预不能有效改善上述异常。 糖尿病大鼠脊髓、DRG和坐骨神经均存在IgA、IgG、IgM和补体C3b的异常沉积，坐骨神经XgA、IgG和C3b平均光密度值与轴突/髓鞘面积比值存在显著负相关；中高剂量的CsA治疗可有效抑制上述物质在神经组织的沉积，胰岛素治疗不能纠正此种异常改变，低剂量CsA干预仅对上述部分指标有效。 糖尿病大鼠脊髓、DRG 和坐骨神经局部 MDA 水平显著升高，DRG 和坐骨神经 T-SOD、CuZn-SOD、CAT 和 GSH-Px 水平均显著降低，脊髓仅 CuZn-SOD和 GSH-Px 水平显著降低；中高剂量的 CsA 和胰岛素治疗均可改善上述异常；糖尿病大鼠神经组织局部NF-κB蛋白表达、TNF-αmRNA 和蛋白表达均显著增高，中高剂量的 CsA 和胰岛素治疗均可抑制 NF-κB的表达，但仅中高剂量的CsA 能显著降低TNF-αmRNA 和蛋白的表达。低剂量CsA治疗仅对上述部分指标有效。 结论：16周龄STZ诱导的糖尿病大鼠脊髓、DRG 和坐骨神经均存在免疫球蛋白和 C3b 的异常沉积，证实体液免疫反应参与了 DPN 的发生；1mg/kg·d、2mg/kg·d CsA 免疫干预治疗可有效减少神经系统上述部位免疫球蛋白和补体C3b的沉积，而胰岛素治疗不能改善此种免疫异常，提示此种免疫异常独立于高血糖之外发挥作用。 16周龄STZ诱导的糖尿病大鼠脊髓、DRG和坐骨神经均存在氧化应激水平的增高、NF-κB 的激活和下游TNF-α高表达；1mg/kg·d、2 mg/kg·d CsA 免疫干预治疗可有效抑制上述异常改变，且对WSF-α的抑制作用优于胰岛素治疗，提示免疫系统激活与高血糖可能均为氧化应激的上游机制，而在抑制氧化应激下游炎症因子异常表达方面CsA效果更好。 1 mg/kg·d和2 mg/kg·d CsA免疫抑制治疗均能有效地延缓DPN的进展，为期16周上述剂量的CsA治疗未导致明显的肝肾功能损伤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一部分 环孢素A对STZ诱导的糖尿病病大鼠外周神经病变作用评价

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分STZ诱导的糖尿病大鼠外周神经病变的免疫学机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

第三部分 STZ诱导的糖尿病病大鼠外周神经病变氧化应激和炎症机制及CsA的干预作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢