酪丝亮肽在人肝癌BEL-7402细胞中的定位及其跨膜转运机制的初步研究

摘要

目的：
　　 研究抗肿瘤三肽化合物酪丝亮肽（YSL）在肝癌细胞BEL-7402中的定位，并初步探讨小肽转运蛋白（PEPT1）在YSL跨膜转运中的作用。
　　 方法：
　　 1.建立荧光素5（6）-羧四甲基罗丹明琥珀酰亚氨酯标记YSL的方法，应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对荧光标记YSL进行纯化。
　　 2.应用毛细管电泳技术和荧光分光光度法对荧光标记YSL进行纯度和稳定性鉴定；应用速率比色法测定人肝癌BEI-7402细胞受损后释放的乳酸脱氢酶来鉴定标记YSL的生物学活性。
　　 3.以激光扫描共聚焦显微镜观察标记YSL在体外培养的人肝癌BEL-7402细胞中的分布以及是否与肿瘤细胞的线粒体存在共定位。
　　 4.应用荧光偏振法测定YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞膜流动性的影响，以流式细胞仪测定YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞膜电位的影响，为进一步判定YSL进入肿瘤细胞的方式提供证据。
　　 5.应用分光光度法测定YSL对分离的人肝癌BEL-7402细胞线粒体膜电位和线粒体肿胀的影响，观察YSL是否对肿瘤细胞的线粒体有直接作用。
　　 6.应用免疫荧光方法，观察小肽转运蛋白PEPT1在人肝癌BEL-7402细胞的定位和表达。
　　 7.应用MTS法测定PEPT1的底物GLY-GLN、GLY-SARCOSINE和GLY-GLY-GLY对YSL抑制人肝癌BEL-7402细胞增殖作用的影响；以倒置荧光显微镜观察三种PEPT1的底物对标记YSL进入BEL-7402细胞数量的影响，探讨YSL进入肿瘤细胞过程是否与PEPT1的功能存在关系。
　　 8.应用实时荧光定量PCR法观察YSL，对人肝癌细胞BEL-7402中PEPT1的mRNA水平的影响。
　　 结果：
　　 1.荧光物质5（6）-羧四甲基罗丹明琥珀酰亚氨酯可以稳定地标记YSL。经过20％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后可以得到成分单一的荧光标记
　　 YSL。
　　 2.合成的荧光标记YSL性质稳定：在-20℃条件下避光保存两周，YSL和5（6）羧四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯结合稳定未发生解离，标记YSL的荧光强度和荧光光谱也未发生明显的变化。并且荧光标记YSL体外损伤人肝癌BEL-7402细胞使之释放的LDH与标记前相比未发生明显的下降（P>0.05），即标记前后YSL的抗肿瘤生物学活性未发生明显改变。
　　 3.荧光标记YSL在体外与人肝癌BEL-7402细胞共同孵育时能够进入细胞内，并且在细胞中呈聚集分布，与等浓度的5（6）TAMRA SE在细胞的分布有明显的差别；标记YSL主要分布于BEL-7402细胞的细胞浆中，并且与肿瘤细胞的线粒体呈共定位。
　　 4.YSL（1.6mg/ml）在体外作用BEL-7402细胞能够使细胞膜的微黏度增加，降低细胞膜的流动性；还可以降低肿瘤细胞膜的膜电位，造成细胞膜去极化。
　　 5.YSL直接作用于体外分离的人肝癌BEL-7402细胞线粒体后，能够降低线粒体膜电位，影响线粒体膜通透性，造成线粒体肿胀。
　　 6.在人肝癌BEL-7402细胞中检测到PEPT1蛋白的表达，PEPT1蛋白在BEL-7402细胞主要分布在细胞的胞膜和胞浆。
　　 7.PEPT1的作用底物GLY-SARCOSINE、GLY-GLN和GLY-GLX-GLY可以减弱YSL对人肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制作用，降低标记YSL在体外进入人肝癌BEL-7402细胞的数量。
　　 8.YSL（1.6mg/ml）能够在体外上调人肝癌BEL-7402细胞中PEPT1 mRNA水平。
　　 结论：
　　 应用荧光物质5，6羧四甲基罗丹明琥珀酰亚氨酯可以稳定地标记YSL，并保持YSL原有的抗肿瘤生物活性。YSL可能是跨膜进入到肿瘤细胞的胞质内发挥抗肿瘤作用的，YSL进入肿瘤细胞的过程可能与肿瘤细胞中的小肽转运蛋白PEPT1的转运功能有关。进入肿瘤细胞胞质内的YSL发挥抗肿瘤作用的方式之一可能是通过损伤肿瘤细胞线粒体实现的。