转录共激活因子p100蛋白对转录因子STAT1和STAT6基因转录活性的调控作用

摘要

研究目的：细胞内信号转导的转录响应的基本机制就是信号转导途径最终激活转录因子，并使相应的基因表达和造成细胞行为的改变。JAK/STAT信号转导途径是胞内重要的信号通路之一，其在细胞生成、分化、凋亡等生物学方面有重要的意义，而其参与的调控需要多种转录激活因子的参与。p100蛋白首先作为EBNA2(Epstein-Barr virus nuclear antigen2，EB病毒细胞核抗原2)的转录调控激活因子被发现，研究表明p100蛋白是STAT6，STAT5的转录共激活因子，能增强其转录活性。STAT1与STAT6同属于STAT家族，两者存在高度相似性，p100是否也是STAT1的共激活因子呢？本课题对此作了研究，同时进一步明确p100蛋白与STAT6在活细胞内结合共定位情况，为进一步研究p100蛋白的功能提供依据。 方法：本课题分三大部分进行，第一部分是研究p100蛋白与STAT1或STAT6的相互结合作用。该部分从两方面研究p100蛋白与STAT1或STAT6的相互结合作用。其一是采用GST pull down技术来研究p100蛋白与STAT1或STAT6的体外结合作用，其二采用免疫共沉淀(CO-IP)研究p100蛋白与STAT1或STAT6的体内结合作用；第二部分是采用虫荧光素酶报告基因检测p100蛋白及其片段调控STAT1或STAT6的转录活性；第三部分是观察p100蛋白及其片段与STAT6的定位观察。首先构建以绿色或红色荧光蛋白为报告基因的重组质粒pEGFP-CI-STAT6和pERFP-CI-STAT6，其次转染入HeLa细胞，经刺激后在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的运动变化。 结果： ①p100蛋白，p100-SN能够与STAT6结合，但p100-TSN不能与STAT6结合。p100不能与STAT1结合。②虫荧光素酶检测到p100蛋白，p100-SN能够增强STAT6的基因转录活性，但p100-TSN不能够增强STAT6的基因转录活性。p100不能够增强STAT1的基因转录活性。③成功构建质粒pEGFP-CI-STAT1和pERFP-CI-STAT6，并能够在HeLa细胞中实现表达。在激光共聚焦显微镜下观察到p100蛋白，p100-SN蛋白能够在IL-4刺激下与STAT6共同进入核内，而p100-TSN不能相应的进入核内。 结论： ①p100蛋白及其SN片段能够与STAT6结合，并能够增强STAT6的转录活性，而且呈剂量依赖性，TSN片段不能与STAT6结合，亦不能影响STAT6基因转录活性；p100蛋白不能与STAT1结合，且不能影响其转录活性。②成功构建重组质粒pEGFP-CI-STAT6和pERFP-CI-STAT6，并实现其在细胞中的表达。在激光共聚焦显微镜下观察在活细胞状态下蛋白的运动情况，在IL-4刺激下，STAT6和p100蛋白能够进入核内，p100-SN和STAT6也在同样的条件下进入核内，提示它们在细胞内存在共定位。而在IL-4刺激下，p100-TSN不能相应的进入细胞核内，提示与STAT6不存在共定位。③在IL-4长时间刺激下，可见到STAT6在细胞核内聚集成颗粒状物质，具体原因与机制有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、p100蛋白及其片段与STAT1或STAT6的相互结合作用

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、虫荧光素酶报告基因检测p100蛋白调控STAT1或STAT6转录活性

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4 小 结

三、p100蛋白及其片段与STAT6的定位观察

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述：JAK-STAT信号转导途径研究新进展及其与疾病发生的关系

致谢