正常和单眼形觉剥夺大鼠视皮层Neuritin mRNA和蛋白表达的研究

摘要

目的： 本实验通过SYBRgreenI荧光定量RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测正常和单眼形觉剥夺大鼠视皮层NeuritinmRNA和蛋白的动态表达，研究Neuritin与视觉经验和年龄的相关性，及形觉剥夺对其表达的影响，以期从分子水平探讨Neuritin与视觉发育的相关性，为弱视的发病机制提供理论依据。 方法： 1.健康Wistar大鼠50只，雌雄不限，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心(天津)提供，分为10组，每组5只，正常饲养，单眼形觉剥夺(MD)组于出生后第14天制作右眼形觉剥夺模型，分组情况：正常组分别为NP7、NP14、NP21、NP28、NP45和NP90组，MD组分别为MD21、MD28、MD45和MD90组。所有大鼠分别饲养至所需要的天数时麻醉、断头、取脑(MD组取左侧视皮层脑组织)、提取总RNA，总RNA质量和纯度的检测，逆转录为cDNA，半定量PCR反应，SYBRgreenI荧光定量RT-PCR反应，反应结束后用计算机将样本与标准品对比，并结合内参照得到大鼠视皮层组织NeuritinmRNA的相对表达量。各组计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，采用SPSS16.0统计分析软件对mRNA相对表达量进行处理，相同时间段的两组间比较采用独立样本的t检验，发育不同时限多组间比较采用单因素方差分析。 2.实验大鼠分组情况和单眼剥夺模型的制作同第一部分。大鼠分别饲养至所需要的天数时麻醉、灌注、固定、开颅、冠状切取后部脑组织，置于4％多聚甲醛固定液中24-48h后，常规石蜡包埋。行4μn冠状连续切片，行常规HE和免疫组织化学方法染色。显微镜下观察Neuritin蛋白在视皮层中的表达情况。Olympus显微摄像系统采集图片，采用图像分析软件进行累计光密度(IOD)值测定。对IOD值进行分析和比较，实验数据以-x±s表示，采用SPSS16.0处理数据，MD组与正常组间采用成组设计的t检验，同组发育不同时限的IOD值采用单因素方差分析。 结果： 1.(1)标准曲线结果：从溶解曲线图可知大鼠视皮层Neuritin和内参照GAPDHmRNA无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物，无引物二聚体和发卡结构；扩增曲线和标准曲线图的线性关系良好，在该实验浓度范围内能够进行准确定量。(2)正常大鼠视皮层NeuritinmRNA表达：正常大鼠视皮层中NeuritinmRNA的相对表达量随年龄增长呈发育性变化，即睁眼前视皮层中就已存在，但含量很少，其相对表达值P7为0.152±0.011，随后表达逐渐上升，P14天为0.234±0.052，P21天为0.527±0.047，在P28天表达量达峰值，为0.846±0.067，后略有下降，P45天为0.445±0.020，至成年后维持于一定水平，其相对值为0.410±0.017，单因素方差分析各年龄段间NeuritinmRNA的相对表达差异具有显著性(F=177.52，P<0.01)。(3)MD组大鼠视皮层NeuritinmRNA表达：MD21相对表达值为0.412±0.015，MD28相对值为0.501±0.019，MD45相对值为0.381±0.030，MD90相对值为0.384±0.015，单因素方差分析各年龄段间NeuritinmRNA的相对表达量差异具有显著性(F=36.93，P<0.01)。各个时间段MD组与正常组比较其相对表达量均有明显减少，差异有显著性(t21=5.262，P<0.01.t28=11.223，P<0.00、ts=3.970，P<0.01、t90=2.492，P<0.05)。 2.(1)HE染色结果：正常发育组大鼠视皮层的神经元分布呈层状，从皮质浅层至深层依次分为分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层和多形细胞层，各层神经元排列整齐。MD组大鼠视皮层未见明显异常。 (2)不同发育时限大鼠视皮层Neuritin的表达：光镜下可见Neuritin的阳性反应产物呈棕黄色点状或颗粒状，主要位于神经元细胞膜，神经元胞体、胞核不被标记。在视皮层各层均可见Neuritin阳性颗粒。比较不同发育时限的正常组NeuritinIOD值，可以看出正常发育组Neuritin的阳性表达随年龄呈发育性变化，P7Neuritin蛋白表达量很少，其IOD值为6.48±0.62，睁眼后表达量明显增加P14天时其IOD值为14.56±2.37，P21天有明显升高，达到23.36±4.28，P28天时达高峰，为67.94±5.98，随后开始下降，P45天时持续在较高水平，其IOD值为26.85±2.33。单因素方差分析各年龄段间Neuritin阳性表达产物差异具有显著性(P<0.05)。MD组Neuritin阳性表达产物明显减少，表现为密度减低及数量减少。其IOD值在P21天为18.17±1.42(t=2.571，P<0.05)，P28为30.92±2.17(t=6.802，P<0.01)，P45为19.33±2.08(t=5.379，P<0.01)。 结论： 1.不同发育时限的大鼠视皮层组织中均有NeuritinmRNA表达，其表达的蛋白在视皮层各层均有表达，且两者呈同步性。推测Neuritin基因参与了视觉系统发育，可能对视皮层神经元的发育和成熟起着重要作用。 2.NeuritinmRNA和蛋白的表达受年龄因素的影响，其表达变化规律与视觉发育关键期的起始和终止时间相符合。 3.视觉经验对于发育期视皮层NeuritinmRNA和蛋白的表达有调控作用，异常视觉经验影响其表达，表明Neuritin的表达随视觉发育呈现活动依赖性表达，从分子水平为弱视发病机制的研究提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、SYBRgreen Ⅰ荧光定量RT-PCR方法检测正常和单眼形觉剥夺大鼠视皮层Neuritin mRNA的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、免疫组织化学方法检测正常和单眼形觉剥夺大鼠视皮层Neuritin蛋白的表达

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

在学期间发表论文和参加科研情况

综述 神经营养因子类在视觉系统发育及其可塑性

致谢