microRNA靶序列单核苷酸多态性与乳腺癌发生、发展的关联研究及生物信息学分析

摘要

乳腺癌是危害女性健康的最常见恶性肿瘤，其病因与环境暴露有关，个体遗传易感性起重要作用。近年，研究人员发现了一种新的基因表达调控机制，即microRNA介导的转录后负调控。许多肿瘤相关基因都受到microRNA的调控，调控机制的核心是microRNA种子区与相关基因mRNA上靶序列的Waston-Crick配对识别，引起mRNA的翻译抑制。靶序列的单核苷酸变异会干扰或破坏microRNA的结合与转录后调控，从而影响基因的表达和功能，改变个体的肿瘤易感性。在总结相关生物信息学资料的基础上，结合中国人群的特点，本研究选取靶序列存在SNP的乳腺癌相关基因SET8和IQGAP1，通过大样本病例对照研究，检测这两个基因microRNA靶序列单核苷酸多态性的基因型频率在乳腺癌患者和对照人群的分布差异，探索microRNA靶序列SNP与乳腺癌发病风险及患者临床特征的关联。通过本研究，同时总结当前同类研究存在的问题，提出新的研究思路，并为此开展了系统性的microRNA靶序列单核苷酸多态性的生物信息学检索与分析，提出了适合在中国人群中开展的microRNA靶序列SNP与肿瘤关联研究的新模式和新概念。
　　 目的：
　　 第一：研究组蛋白H4甲基转移酶基因-SET8基因3’非翻译区miR-502靶序列SNP rs16917496，以及它与下游基因TP53密码子72 SNP rs1042522的交互作用与乳腺癌发病的关联，以及对乳腺癌发病年龄的影响。
　　 第二：研究细胞骨架蛋白编码基因-IQGAP1基因miR-124靶序列SNPrs1042538与乳腺癌发病和预后的关联及其作用机制。
　　 第三：通过全面检索并分析中国人群肿瘤相关基因microRNA靶序列单核苷酸多态性的信息，为今后我国开展系统性的microRNA靶序列SNP与肿瘤的关联研究提供参考。
　　 方法：
　　 在SET8基因miR-502靶序列SNP rs16917496与乳腺癌的病例对照研究中，我们选取1，110例乳腺癌病例和1，097例对照，用PCR-RFLP法检测病例和对照的SET8和TP53基因型，采用SAS软件分析不同基因型或基因型组合与乳腺癌发病风险及发病年龄的关联。选取一定数量的携带SET8 CC和TT基因型的病例检测SET8基因和miR-502的表达。此后，我们继续收集病例和对照，采用TaqMan探针技术对1，541例乳腺癌病例和1，598例健康对照进行IQGAP1 SNP rs1042538A/T的基因型检测，分析基因型及其与环境因素交互作用对乳腺癌易感性的影响；利用公共的生物信息数据库资源分析了IQGAP1表达与乳腺癌、神经胶质瘤和胃癌之间的关联；在正常乳腺上皮细胞系MCF10A和乳腺癌细胞系MCF7中沉默IQGAP1表达，观察细胞增殖活性的变化。最后，我们选取microRNA靶序列变异权威数据库“Patrocles”和“PolymiRTS”，以及其它有关数据库。采用两数据库比对的方式，按照预先设定的种子区类型和SNP频率标准，逐步筛选肿瘤相关基因microRNA靶序列的中国人群高频率SNP，并分析SNP的功能类型和联合模式。
　　 结果：
　　 SET8基因SNP与乳腺癌的关联研究中，在绝经前妇女，相对于SET8 TT基因型，SET8 CC基因型显著增加乳腺癌发病风险（OR=1.66:95％CI，1.06-2.61）。此外，SET8 CC基因型和TP53 GG基因型均可以使乳腺癌发病年龄提前，而且存在等位基因数量.反应关系。两个基因的9种基因型组合乳腺癌发病年龄存在显著性趋势，同时携带SET8 CC基因型和TP53 GG基因型的患者发病平均年龄是47.74岁，而同时携带SET8 TT和TP53 CC基因型者发病平均年龄为54.55岁。表达量分析显示，SET8 CC基因型病例SET8表达显著低于TT基因型，而miR-502表达在不同基因型之间差异无统计学意义。
　　 IQGAP1基因SNP与乳腺癌的关联研究发现，与IQGAP1的AA基因型相比，TT基因型显著降低乳腺癌发病风险（OR=0.78；95％CI，0.61-0.99）。在病例分析中，TT基因型乳腺癌患者孕激素受体（PR）阳性率显著高于AA基因型，（OR=1.35:95％CI，1.00-1.83）。IQGAP1表达降低在乳腺上皮细胞系中引起细胞增殖活性增强，而在乳腺癌细胞系中引起细胞增殖活性减弱。IQGAP1表达水平与神经胶质瘤生存时间有关，但与乳腺癌和胃癌预后无关。
　　 生物信息学研究中，我们由Patrocles数据库检出1，742个micorKNA靶序列确认（Validated）SNP；经dbSNP数据库的SNP频率检索，获得404个中国人群高频率SNP；经pubmed数据库检索，其中154个SNP所在基因是肿瘤相关基因:154个肿瘤相关基因microRNA靶序列SNP中，131个是独立SNP，23个是并联SNP；10个包含并联SNP的基因中，8个是顺势并联，2个是反式并联；经PolymiRTS数据库比对，154个SNP中两数据库共有的SNP42个；这42个SNP中，破坏型SNP22个，建立型SNP3个，转换型SNP17个。
　　 结论：
　　 SET8基因miR-502靶序列SNP调控SET8的表达，与乳腺癌发病风险和发病年龄有关，且与TP53密码子72 SNP存在联合作用；IQGAP1基因miR-124靶序列的SNP与乳腺癌发病和预后都有一定关联，IQGAP1在不同的类型组织中致癌作用不同，在肿瘤发生和发展不同阶段的作用也有差异；系统性的microRNA靶序列SNP研究具有重要意义，在整体评估microRNA靶序列SNP与肿瘤关联的同时，应注重SNP的功能类型和联合模式研究。