受体源骨髓间充质干细胞对大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的影响

摘要

第一部分、大鼠小肠移植慢性排斥反应模型的建立及病理学比较
　　 目的：采用F344-Lewis大鼠组合初步建立大鼠小肠移植慢性排斥反应模型，观测小肠组织慢性排斥病理表现。
　　 方法：利用显微外科技术构建异系异位和异系原位大鼠小肠移植模型，术后0-14天给予皮下注射环孢素。术后90天进行移植物活检，常规病理学检测。乳果糖/甘露醇比值、D-木糖吸收实验检测移植肠功能。
　　 结果：（1）异位和原位小肠移植大鼠均能长期存活，大部分超过90天。（2）异位小肠移植在术后90天出现典型的慢性排斥反应的病理学特征，包括粘膜结构改变、间质纤维化、白细胞浸润和动脉内膜增殖。（3）术后90天的原位移植小肠组织学形态相对正常。原位小肠移植大鼠在术后150天左右具有慢性排斥的病理组织学特征，但病变程度轻于术后90天的异位移植小肠。（4）大部分原位小肠移植大鼠在术后150天出现持续的体重下降，且不能被环孢素逆转。当体重下降超过30％时，乳果糖/甘露醇比值和D-木糖吸收实验结果证实移植肠功能下降。
　　 结论：（1）异位小肠移植在术后90天出现典型的慢性排斥反应的病理学改变，而原位小肠移植在该时间点无慢性排斥反应改变。（2）原位小肠移植于术后150天左右出现慢性排斥改变，以持续性体重下降为临床表现，并伴随肠道吸收功能以及屏障功能的下降。（3）F344-Lewis异位小肠移植手术操作相对简单，经练习后手术成功率可达85％以上。（4）由于异位小肠移植可以出现典型的慢性排斥反应的组织病理学特征，故后继实验采用F344-Lewis异位小肠移植模型，并根据组织病理学检查结果确定术后90天为观察终点。
　　 第二部分、大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的研究
　　 目的：建立大鼠异位小肠移植模型并研究相关慢性排斥反应机理。
　　 方法：利用显微外科技术构建同系和异系大鼠小肠移植模型，分为3组：同系移植组、异系移植组、异系治疗组（给予环孢素）。分别在术后7天、14天、30天、60天、90天进行移植物活检，常规病理学检测，建立小肠移植排斥反应组织学评分标准。应用Real time-PCR技术检测移植物内TGFβ1、PDGF、PDGF-CmRNA转录水平，采用免疫组织化学方法检测CD68、TFGFβ1、PDGF-C表达情况。
　　 结果：（1）异系对照组全部大鼠均在术后15天内死亡。（2）异系治疗组自术后14天开始炎细胞浸润程度病理评分显著高于同期同系对照组，术后30天粘膜结构变化以及纤维化程度病理评分显著高于同期对照组，术后60天动脉内膜增殖开始有显著差异（3）CD68检测提示在慢性排斥反应全程CD68的表达持续升高，术后60天达最高水平。（4）异系治疗组的TGF-β1及PDGF-C mRNA转录水平和蛋白表达水平在第60天较同期的同系移植组显著升高，免疫组化可见TFGF-β1在间质高表达，PDGF-C主要由组织细胞高表达于胞浆及胞膜。
　　 结论：（1）术后第60天环孢素组的单核巨噬细胞浸润严重，同时伴TGFβ1、PDGF-C的高表达。（2）异系治疗组术后60天即可出现慢性排斥反应表现，并同时伴有CD68、TGFβ1、PDGF-C分子的显著高表达，提示CD68、TGFβ1、PDGF-C对于判定慢性排斥反应具有指导意义。
　　 第三部分、大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定
　　 目的：建立稳定的大鼠间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法，为进一步开展研究MSCs对小肠移植慢性排斥反应的影响提供细胞来源。
　　 方法：选用1月龄清洁级Lewis大鼠，处死消毒后取其长骨，用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，收集冲洗液，采用密度梯度离心法分离获取细胞，培养后取贴壁细胞进行传代培养。取第3代生长状态良好的细胞，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化制成细胞悬液计数并记录生长曲线。取第3、4、5代生长状态良好细胞，以流式细胞术鉴定细胞表型。取第3代MSCs定向诱导分化成骨细胞，采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色进行成骨细胞鉴定。CFSE标记第3代MSCs并观察标记效率。
　　 结果：（1）体外培养的原代MSCs72小时可见贴壁细胞，3周左右可达到90％的融合，2代后即可得到较为纯化的MSC成纤维样细胞。（2）流式细胞仪检测第3代MSCs表面标记物CD29、CD90的阳性率可达96％以上，CD34、CD45的阳性率低于3％。（3）碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果证实成骨细胞诱导成功。（4）用CFSE进行细胞标记后，荧光显微镜下见几乎所有MSCs均已被标记绿色荧光，流式细胞仪检测结果显示标记比例达100％，提示CFSE标记效率高。
　　 结论：（1）MSCs是一类增殖能力旺盛，具有多向分化潜能的干细胞。（2）密度梯度离心联合贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法，操作简单，成功率高，可以作为培养大鼠骨髓MSCs的常规方法。（3）CFSE标记可作为标记MSCs的一种有效手段。
　　 第四部分、大鼠骨髓间充质干细胞体外免疫抑制功能的实验研究
　　 目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在混合淋巴细胞培养反应中对同种异体脾细胞免疫应答反应的影响，并初步探讨其作用机制。
　　 方法：建立MSCs和同种异体脾细胞共培养体系，反应体系总量300ul，以刀豆蛋白A为刺激因素，CFSE标记部分反应细胞。共分4组：①脾细胞，②脾细胞+conA，③脾细胞+MSCs，④脾细胞+MSCs+conA，每组6复孔，每孔脾细胞数5×105个，MSCs为105个，ConA终浓度为10ug/ml。混合培养72小时后，于倒置荧光显微镜下观察细胞增殖情况，流式细胞仪分析荧光强度以及CD4、CD8比例。
　　 结果：MSCs和脾细胞共培养组未见明显的增殖子峰，其中CD4、CD8阳性细胞表达明显下降，而CD4/CD8比值无明显变化。
　　 结论：骨髓MSCs体外能够抑制刀豆蛋白A引起的淋巴细胞增殖反应，对CD4T细胞、CD8T细胞均有抑制作用。
　　 第五部分、受体源骨髓间充质干细胞对大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的影响
　　 目的：研究静脉输注受体骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠异位小肠移植慢性排斥反应的影响及其机制。
　　 方法：利用显微外科技术构建异系小肠移植模型16只，随机分为2组：对照组和MSCs输注组。小肠移植后24小时，确定手术成功后，MSCs组自阴茎背静脉输注骨髓间充质干细胞107个（溶液为2ml生理盐水），对照组给予同体积的生理盐水，术后0～14天两组均给予环孢素处理。观察两组移植大鼠术后生存状态，于术后第60天全部剖杀获取移植小肠。常规病理学检测，进行慢性排斥反应病理评分。应用Realtime-PCR技术检测移植物内TGFβ1、PDGF-CmRNA转录水平，采用免疫组织化学方法检测CD68、TGFβ1、PDGF-C表达情况。另外再建立两只大鼠异位小肠移植模型，给予环孢素处理，术后24小时给予阴茎背静脉输注标记了荧光CFSE的骨髓MSCs，术后7天剖杀获取移植小肠以及自体其他组织器官备冰冻切片检查以观察MSCs在受体内的定位。
　　 结果：（1）输注的骨髓MSCs可特异的定向迁移至移植小肠。（2）术后60天MSCs组小肠标本的粘膜结构、炎细胞浸润、纤维化程度和动脉内膜增殖程度的评分与环孢素组均有统计学差异。（3）术后60天MSCs组小肠标本表达CD68、TGFβ1、PDGF-C分子水平均低于环孢素组。
　　 结论： MSCs在一定程度上能移抑制慢性排斥的进程，其作用机制可能是MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用，减少了巨噬细胞浸润以及TGFβ1、PDGF-C分子的表达。