多西环素抑制黑色素瘤细胞黏附的分子机制研究

摘要

目的：以高血道转移的恶性肿瘤--黑色素瘤为研究模型，利用细胞毒实验、黏附实验、流式细胞术、免疫荧光染色、Western Blot和荷瘤动物模型等技术，研究多西环素对黑色素瘤细胞黏附的抑制作用及分子机制。初步阐明该药对恶性黑色素瘤的抑制作用及其机制，进而为探索恶性黑色素瘤治疗新途径提供实验依据。
　　 方法：对黑色素瘤细胞系B16F110、WM1351、WM451分别在贴壁前后按照药物浓度梯度给药处理，通过MTT实验分两种给药模式，即铺板后立即给药(贴壁前处理)和培养24h后再给药(贴壁后处理)，以不含药物的生理盐水作为溶剂对照组，观察贴壁前和贴壁后给予多西环素处理的数据差异。为进一步评价药效并量化，对三种黑色素瘤细胞进行细胞黏附实验，观察多西环素对三种细胞的抑制黏附作用和差异。为进一步验证多西环素处理细胞干扰极化作用后是否会出现早期细胞凋亡，又基于AnnexinV-PI流式细胞术分析了多西环素对黑色素瘤细胞失巢凋亡的诱导作用。通过免疫荧光染色法观察多西环素处理后细胞骨架变化。利用Western Blot技术检测三种细胞FAK表达及其磷酸化水平的变化。利用C57/BL小鼠建立荷瘤模型，20只小鼠随机分组为2组，即处理组与对照组。8 d后移植部位可触及肿瘤，此时给予多西环素腹腔注射，对照组注射同剂量生理盐水。给药3 d后处死小鼠，获取肿瘤组织进行Western Blot检测FAK及其磷酸化水平的变化。
　　 结果：MTT实验结果显示“贴壁前”加药的细胞抑制率显著高于“贴壁后”加药组，细胞形态学上主要表现为悬浮的球形，该现象提示多西环素可能对肿瘤细胞的黏附作用产生影响。细胞黏附实验结果显示多西环素对这三种黑色素瘤细胞均有黏附抑制作用，在0.1μg/mL孵育6 h与对照组相比细胞黏附率下降80％，多西环素对WM451细胞的黏附抑制作用稍逊于其他两种细胞。AnnexinV-PI流式细胞术分析了多西环素对黑色素瘤细胞失巢凋亡的诱导作用，结果显示对B16F10细胞用1μg/mL多西环素处理2 h后早期凋亡的比例增高约9倍。通过免疫荧光染色法对黑色素瘤B16F10进行微丝蛋白和微管蛋白的染色发现：1μg/mL和10μg/mL多西环素处理细胞12 h后，可见到微管的解聚、溶解和微丝的异常聚集浓缩，在高浓度多西环素处理下细胞发生了皱缩和核内染色质的聚集。Western Blot结果显示，利用多西环素处理12 h后，B16F10、WM351和WM451三种细胞均出现了不同程度的FAK表达水平降低，而FAK在酪氨酸397位置上的磷酸化程度也显著降低，在1μg/mL的药物浓度下，三种细胞系的FAK磷酸化水平降低了80％以上。小鼠荷瘤模型实验中，在给药第三天时即处死动物获得肿瘤组织用于FAK及其磷酸化的检测，结果表明FAK及其磷酸化水平均有明显改变，给药组比对照组降低低于50％(P<0.05)。
　　 结论：多西环素可能通过抑制黑色素瘤细胞的FAK及其磷酸化，从而干扰肿瘤细胞的黏附作用，进而起到抗肿瘤作用。该分子机制的提出将有助于进一步评价多西环素的临床抗肿瘤作用，也为阐明深入的分子机制奠定了基础。