组织型纤溶酶原激活剂和neuroserpin的神经保护作用

摘要

目的：tPA是中枢神经系统内重要的丝氨酸蛋白激酶，tPA与其抑制剂neuroserpin在神经元的生长、发育以及多种病理条件下发挥作用。海马和皮层区是对缺血性损害比较敏感的脑区，也有较高的tPA和neuroserpin活性。本研究的主要目的是阐明急性脑缺血时tPA和neuroserpin对神经元的作用。
　　 方法：本研究观察体外模型中不同程度的氧糖剥夺对海马、皮层区神经元tPA活性和对野生型和tPA基因敲除小鼠神经元生存的影响。体内模型利用双侧颈总动脉阻塞或大脑中动脉阻塞模型造成全脑或局部脑缺血，观察不同程度的缺血对海马、皮层区内源性tPA和neuroserpin活性影响和对野生型和。tPA基因敲除小鼠神经元生存的影响。同时，利用外源性tPA和neuroserpin作为一种预处理的方法，评价不同时间的预处理对神经元的保护作用和相关机制。
　　 结果：明胶酶谱法显示，正常情况下海马CA1区缺乏tPA的蛋白水解活性，在亚致死性缺血发作时，皮层和海马CA1区tPA的表达快速增加。这种内源性tPA可以减少致死性缺血损害后海马神经元死亡，但对于皮层神经元则没有保护作用。tPA和纤溶酶原基因敲除小鼠海马CA1区因为缺乏tPA和纤溶酶的活性没有使神经元在随后的致死性缺血性损害中得到保护。在致死性缺血损害的同时，若给予500nM的外源性tPA可以使海马区神经元的存活从55.71±1.9％提高到73.6±6.4％，无活性tPA使神经元的存活提高到80.02±1.55％。α2-抗血纤溶酶、MK801和渥曼青霉素没有减弱tPA的保护作用，而且单独给予纤溶酶也没有早期预处理作用，RAP完全消除tPA的早期预处理作用。在致死性缺血损害发生前24小时，给予60nM的tPA即可以使神经元生存率从62±2.88％升至88.28±2.72％，单独给予纤溶酶可使神经元生存率提高到86.44±1.64％，而无活性tPA和纤溶酶原并没有神经保护作用。α2-抗血纤溶酶、抑肽酶和ε-氨基已酸、MK801和渥曼青霉素均减弱tPA的保护作用，RAP增加了tPA的延迟预处理作用。与早期预处理不同，tPA可以减弱卡英酸导致的兴奋性毒性。
　　 免疫组化显示，正常情况下皮层和海马区存在少量neuroserpin的表达。亚致死性缺血发作诱发皮层和海马区neuroserpin的表达增加。给予外源性neuroserpin有比较显著的早期预处理作用，可以使野生型和tPA-/-小鼠海马神经元生存率分别增加到83.3±3.8％和92.0±1.6％；皮层神经元生存率分别增加到79.8±2.2％和82.3±2.4％。MK-801或neuroserpin可阻止纤溶酶导致的神经元死亡，生存率分别从74.2±1.7％上升至88.8±1.1％和94.0±1.3％。neuroserpin也可以减弱卡英酸导致的兴奋性毒性，使生存率升至98.3±2.3％。MCAO后给予外源性neuroserpin使野生型和tPA-/-小鼠脑梗死体积分别降低了48.3％和32.7％。
　　 结论：预处理诱发的内源性tPA保护小鼠海马神经元，但对皮层神经元并没有保护作用。外源性tPA的早期预处理作用独立于纤溶酶原/纤溶酶系统，也不依赖于NMDA受体激活和Akt的磷酸化，而需与低密度脂蛋白受体家族相互作用激活细胞信号通路介导早期神经保护。tPA的延迟预处理作用需要他的蛋白水解活性，使纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶裂解NMDA受体的NR2A亚基使之激活，进而介导Akt磷酸化起到神经保护作用。预处理诱发的内源性neuroserpin保护小鼠海马和皮层神经元。neuroserpin的神经保护作用很大程度依赖于抑制了纤溶酶激活NMDA受体介导的兴奋性毒性细胞死亡，而不依赖其抑制tPA的能力。