TAT介导的磁性纳米脂质体对脊髓损伤区域靶向分布的实验研究

摘要

[目的]
　　 探讨一种FITC标记TAT介导的磁性纳米脂质体的制备和表征，在体外与雪旺细胞共培养的透膜能力；同时观察其在大鼠脊髓损伤后在脊髓组织局部聚集的情况，研究其对损伤大鼠脊髓分布的靶向性，为将来该脂质体介导药物治疗脊髓损伤确定提供实验依据。
　　 [材料与方法]
　　 本实验采用反相蒸发法制备兼具跨膜、长循环功能及包覆疏水性超顺磁性Fe3O4颗粒的TAT磁性纳米脂质体，透射电镜，粒径仪和Zeta电位仪测定脂质体粒径和基本表征。
　　 通过结扎Wistar成年大鼠单侧隐神经激活雪旺细胞，采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养雪旺细胞；应用低浓度胶原酶、胰酶快速消化法和差速贴壁法纯化雪旺细胞。用S-100抗体、DAPI染色来鉴定雪旺细胞的纯度。将雪旺细胞分别与外接TAT磁性纳米脂质体及未接TAT磁性纳米脂质体共孵育，对照组加入未接TAT的磁性纳米脂质体(59μg/ml)0.5ml：实验组加入外接TAT的磁性纳米脂质体(59μg/ml)0.5ml，5％CO2，37℃共孵育1小时，在荧光显微镜下观察雪旺细胞对脂质体的摄取情况。
　　 本实验采用雌性Wistar大鼠16只，用IMPACTOR MODEL-Ⅱ打击器建立T10脊髓损伤(spinal cord injury，SCI))模型(10g×25mm)。造模成功后随机分为2组，分别于24小时通过尾静脉注射FITC标记的磁性纳米脂质体(1mg/kg)，对照组注射未接TAT的磁性纳米脂质体，实验组加入外接TAT的磁性纳米脂质体注射后1小时处死大鼠，取出脊髓组织作5μm快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察脂质体在脊髓组织中的聚集情况，同时取大鼠肝脏、脾脏、肾脏作冰冻切片并在荧光显微镜下观察脂质体被其它器官摄取情况。
　　 成年雌性Wistar大鼠16只，随机分为两组，对照组未作脊髓损伤处理，仅采取相同剂量进行麻醉，实验组建立脊髓损伤模型，两组动物均在尾静脉途径注射外接TAT的磁性纳米脂质体(1mg/kg)，实验组时间点选取为伤后24小时，对照组为麻醉后24小时加制作模型所需时间。注射后1小时处死大鼠，取出脊髓组织作5μm快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察脂质体在脊髓组织中的聚集情况。
　　 [结果]
　　 1.磁性脂质体呈球形，分散性较好，粒径较小，Zeta电位较高，外接TAT组与未接TAT组粒径及Zeta电位无明显差别。
　　 2.激活态雪旺细胞经分离、培养、纯化后，细胞生长旺盛。传至第4代时，低倍镜下几乎不见成纤维样细胞。雪旺细胞纯度达到95％以上。
　　 3.细胞摄取实验外接TAT的脂质体更多的聚集在雪旺细胞内部，并大多聚集在细胞核周围，而未接TAT的脂质体较少进入雪旺细胞，比较二者的镜下FITC荧光的平均光密度(average optical density，AOD)，二者具有统计学差异。
　　 4.在荧光显微镜蓝色荧光激发下，FITC使磁性纳米脂质体呈现绿色荧光。在大鼠损伤脊髓组织中，外接TAT的脂质体更多的聚集在损伤脊髓周围，神经元细胞的胞浆中存在大量的荧光颗粒，聚集成片状显现出对核的趋向性，而未接TAT的脂质体则较少分布于受损脊髓。计算二者AOD值，结果具有统计学意义。
　　 5.在荧光显微镜蓝色荧光激发下，未接TAT组的肝、脾、肾脏中均可见明亮的绿色荧光，外接TAT组绿色荧光相对较弱。
　　 6.在荧光显微镜蓝色荧光激发下，正常大鼠脊髓组织中绿色荧光较少，而脊髓损伤大鼠的脊髓中聚集了大量的绿色荧光，计算二者AOD值，结果具有统计学意义。
　　 [结论]
　　 本研究证明了TAT介导的脂质体可大量进入受损脊髓，进入神经元细胞，并且具有靶向聚集受损脊髓组织的特性，为其成为装载治疗脊髓损伤药物的载体提供了可行性依据。