PSMA增强子/启动子驱动shRNA靶向干扰前列腺癌核干因子的动物实验研究

摘要

目的：通过裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型的制作及治疗结果比较，进一步探讨PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因的效果及特异性：研究Tf-PEG-PEI在动物体内的基因转移能力。
　　 方法：将非病毒载体聚乙烯亚胺(PEI)修饰为Tf-PEG-PEI；对已构建成功的pPSMAe/p-UPRT、PSMAe/p-shNS-poly(A)两种质粒，转化细菌，扩增、提取并纯化质粒，进行酶切鉴定及测序鉴定，以确保序列完全正确；培养表达PSMA的LNCap细胞及不表达PSMA的人前列腺癌PC-3细胞系进行对照实验，分别构建LNCap细胞和PC-3细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型，根据不同组别肿瘤局部多点注射不同的质粒及载体复合物，观测治疗过程中肿瘤体积和测量最终重量，免疫组织化学染色法观察各组中NS蛋白表达情况，Western blot检测NS基因的蛋白表达，从而证实PSMAe/p驱动干扰片断的细胞特异性和Tf-PEG-PEI高效靶向基因转移的能力，为治疗前列腺癌提供实验基础和理论依据。
　　 结果：LNCap细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，通过计算肿瘤体积和绘制肿瘤生长曲线，发现分别以PEI及Tf-PEG-PEI为载体的实验组与其余三组相比，在治疗过程中肿瘤体积均明显减小，差别均具有统计学意义(P<0.05)，特别是在治疗的前两个周期，肿瘤的生长更为缓慢，随着肿瘤体积增大效果降低；PEI和Tf-PEG-PEI为载体的实验组相比，差别也具有统计学意义(P<0.05)，其余三组相比，差别无统计学意义(P>0.05)；PC-3细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，第一组至第五组组间相比，均无统计学差异(P>0.05)。通过治疗结束后，裸鼠处死取出的肿瘤组织的重量比较，发现LNCap细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，分别以PEI及Tf-PEG-PEI为载体的实验组与其余三组相比，肿瘤重量明显较轻，差别均具有统计学意义(P<0.05)；PEI和Tf-PEG-PEI为载体的实验组相比，差别也具有统计学意义(P<0.05))，其余三组相比，差别无统计学意义(P>0.05)；PC-3细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，第一组至第五组组间相比，均无统计学差异(P>0.05)。移植瘤的NS免疫组化染色，LNCap细胞移植瘤组织NS免疫组化染色中，PEI及Tf-PEG-PEI为载体的实验组与其余三组相比，NS染色阳性率明显下降(P<0.01)，且胞浆胞核染色程度减弱。PEI和Tf-PEG-PEI为载体的实验组相比，差别也具有统计学意义(P<0.05)；而其余组之间NS染色阳性率无明显差别(P>0.05)。Western blot检测NS基因的蛋白表达，PEI及Tf-PEG-PEI为载体的实验组与其余三组相比，NS表达明显减弱，差别均具有统计学意义(P<0.05)，PEI和Tf-PEG-PEI为载体的实验组相比，差别也具有统计学意义(P<0.05)；而其余组之间NS表达无明显差别(P>0.05)。PC-3细胞细胞裸鼠前列腺癌皮下荷瘤模型中，第一组至第五组的NS表达各组间相比，均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：Tf-PEG-PEI具有高效靶向基因转移的能力，可将体外的基因片段高效转入裸鼠前列腺癌皮下荷瘤的肿瘤组织中，且经PEG修饰后细胞毒性大大降低，是一个安全、高效的RNA干扰输送系统。在前列腺癌皮下荷瘤模型中，PSMAe/p能在高表达PSMA的LNCap细胞中特异性驱动shRNA转录，而在不表达PSMA的PC-3细胞中未能有效驱动shRNA转录；PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因具有细胞特异性，使用细胞特异性启动子是实现前列腺癌靶向基因治疗的有效策略。