腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究

摘要

目的：
　　通过建立兔增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)动物模型，探讨腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因对PVR增生的抑制作用及机制，评价其治疗PVR的效果。
　　方法：
　　1.PVR动物模型的建立：青紫蓝兔28只，随机分成两组，实验组及对照组各14只。实验组采用玻璃体腔注射人富含血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)联合巩膜外冷冻建立PVR模型，对照组采用玻璃体腔注射兔PRP建立PVR模型。行间接眼底镜、B型超声及HE染色检查，观察PVR程度及视网膜脱离的发生情况。
　　2.p21WAF1/CIP1在PVR发病机制中的作用：青紫蓝兔27只，随机分成两组，正常组3只，实验组24只。正常组不做任何处理；实验组每只兔随机选取一只眼作为实验眼，采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立PVR模型。行蛋白免疫印迹(Western blot，WB)和逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，检测PVR模型建立后第7d、14d、21d及28d视网膜组织中p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA的表达。
　　3.体外实验：体外培养hRPE407细胞，细胞同步化后，分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)组、阴性对照(adenovirus mediated deliveryof non-target control，Ad-NC)组和腺病毒p21WAF1/CIP1载体转染(adenovirusmediated delivery of p21WAF1/CIP1，Ad-p21)组。行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在细胞中的表达；行3-甲基-2-噻唑硫酮(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)试验、流式细胞仪及Transwell检查。
　　4.体内实验：青紫蓝兔50只，随机分成4组，正常对照组2只，PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组各16只。其中PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组按照前述方法建立PVR模型。正常组不做任何处理，PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组于建模后第7 d玻璃体腔分别注入PBS、Ad-NC及Ad-p215ul。第14 d时，行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在视网膜组织中的表达。行间接眼底镜、B型超声及HE染色，观察第28 d各组PVR程度及视网膜脱离的发生情况。
　　结果：
　　1.建模后观察28 d，实验组20眼均发生了视网膜脱离，发生率为100％；对照组，13眼发生了视网膜脱离，发生率为65％，两组差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2.WB和RT-PCR检测结果显示，PVR模型建立后7d、14d、21d及28d视网膜组织内p21WAF1/CIP蛋白及mRNA表达水平均低于正常组，第14 d时表达最低(P<0.01)，而CDK2、cyclin E表达均高于正常组，在第14 d时表达水平最高(P<0.01)。
　　3.WB和RT-PCR检测结果显示在Ad-p21组，p21WAF1/CIP蛋白和mRNA的表达均增高，说明腺病毒成功介导p21WAF1/CIP基因转染人视网膜色素上皮细胞，并稳定表达。MTT检测细胞转染p21WAF1/CIP基因48 h后其增生抑制率达到43.13％，较其它组细胞生长速度减慢。细胞周期检测结果显示，Ad-p21组处于G0/G1期的细胞所占百分比显著高于PBS及Ad-NC组(P<0.01)。Transwell小室检测结果显示Ad-p21组穿膜细胞数，明显低于PBS及Ad-NC组(P<0.01)。
　　4.间接眼底镜及B超结果显示PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组第28d视网膜脱离的发生率分别为100％、91.67％和33.33％。建模后第14 d时，WB和RT-PCR显示Ad-p21组p21WAF1/CIP1蛋白及mRNA的表达显著高于正常组、PBS组及Ad-NC组(P<0.01)，而CDK2、cyclin E表达明显低于其它组(P<0.01)。
　　结论：
　　1.采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻可成功建立了PVR动物模型，视网膜脱离的发生率为100％。
　　2.p21WAF1/CIP1基因在PVR发病机制中可能起着重要作用。
　　3.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因能有效抑制人视网膜色素上皮细胞的增生及迁移。
　　4.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因可有效减轻PVR程度，并降低视网膜脱离发生率。