分子嵌合MHC-I基因小鼠骨髓pre-T细胞的构建及体外实验研究

摘要

目的：构建分子嵌合MHC-1基因小鼠骨髓前体T细胞，探讨其预输注受体降低受体小鼠对供体小鼠来源T细胞刺激反应能力的影响，为研究分子嵌合诱导移植免疫耐受打下基础。
　　方法：采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb，分别将其连入质粒pIRES，构建pIRES-H-2Db、pIRES-H-2Kb质粒，双酶切电泳检测和测序鉴定插入序列。培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞，细胞因子IL-3和SCF诱导分化，流式细胞术检测前体T细胞(pre-T细胞)表面标志Thv-1.2+、CD3-。脂质体分别转染(C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb入BALB/c小鼠pre-T细胞。流式细胞术检测BALB/c小鼠pre-T细胞H-2Db和H-2Kb蛋白的表达。将转染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因的BALB/c小鼠pre-T细胞经尾静脉注射回BALB/c小鼠，饲养7天后取其脾细胞作为反应细胞，用C57BL/6小鼠的脾细胞做刺激细胞，单向混合淋巴细胞培养，改良MTT法检测其增殖效果。
　　结果：①成功获取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb，构建质粒pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb，双酶切鉴定插入序列大小正确，并经测序与Genbank上H-2Db和H-2Kb序列完全一致。②成功体外培养BALB/c小鼠骨髓pre-T细胞，流式细胞术检测Thy-1.2+、CD3-细胞的比例可达64.8％。③脂质体成功转染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db，流式细胞术检测H-2Db蛋白表达为14.6％，与未转染组(0.1％)和转染空质粒组(0.3％)相比有明显升高(p<0.05)；转染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Kb，流式细胞术检测H-2Kb蛋白表达为14.8％，与未转染组(0.1％)和转染空质粒组(0.3％)相比亦有明显升高(p<0.05)。④单向混合淋巴细胞培养显示，共注射组的刺激指数(SI)(0.764±0.074)比空质粒组SI(0.983±0.081)和未转染组SI(0.994±0.142)明显下降(P<0.01)；共注射组与转染质粒pIRES-H-2Db组(0.859±0.085)、转染质粒pIRES-H-2Kb(0.860±0.097)相比，SI值差异有统计学意义(p<0.05)；转染质粒pIRES-H-2Db组、转染质粒pIRES-H-2Kb组与未注射组和转染空质粒组分别比较，差异亦有统计学意义(p<0.05)，而未转染组与转染空质粒组的SI值差异无统计学意义(P>0.05)。
　　结论：①成功构建C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb真核表达质粒。②细胞因子诱导可体外收获BALB/c小鼠骨髓pre-T细胞。⑧C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb成功体外转染至BALB/c小鼠pre-T细胞，且转染后可稳定表达。④体外成功获得分子嵌合MHC-I等位基因受体小鼠pre-T细胞，其能降低受体对异基因供体来源T细胞刺激的反应能力。