硫化氢后处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

摘要

肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia-Reperfusion，HIRI)是一种常见的临床病理生理过程，休克、感染、肝脏外伤、肝叶切除及肝移植所致的肝脏功能损害、衰竭都与之有关。肝脏缺血再灌注损伤机制复杂，目前尚未完全认识清楚，大量研究证明主要与缺血再灌注过程中氧自由基释放、肝脏能量代谢障碍、细胞内钙离子超载、微循环功能障碍、细胞因子、线粒体功能异常、Kupffer细胞激活及中性粒细胞的活化等因素有关。目前，围手术期肝脏缺血再灌注损伤的防治策略包括低温、改良外科技术、药物防治、缺血及药物预处理、基因治疗等方面。但迄今为止，上述众多的策略尚未妥善解决临床肝脏缺血再灌注所致的肝功能不全。气体信号分子是近年来研究的一个热点，近期研究表明硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)广泛存在于哺乳动物组织，其不仅在生理条件下参与机体的功能调节，而且还参与许多疾病的病理过程，其在缺血再灌注过程中的作用也日益受到重视。目前硫化氢对心血管和神经系统的缺血再灌注损伤研究较多，而在肝脏缺血再灌注损伤中是否同样具有保护作用鲜有报道。
　　本研究以大鼠肝缺血再灌注模型为基础，通过评价不同剂量硫化氢后处理对肝脏缺血再灌注损伤的影响，应用ATP敏感性钾通道阻滞剂后对硫化氢后处理保护作用的影响，以及硫氧还蛋白系统在硫化氢后处理减轻肝脏缺血再灌注损伤中的变化，探讨硫化氢后处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制。
　　一、硫化氢后处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响
　　目的：探讨硫化氢后处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响。
　　方法：健康雄性SD大鼠30只，质量220～250g，采用随机数字表法分为5组(n=6)，假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)和不同剂量硫化氢组(H2S1～3组)。Sham组仅暴露肝门，不夹闭动、静脉；IR组采用夹闭左、中叶肝蒂、门静脉和肝动脉支60min，然后松开夹闭恢复灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注模型；H2S1～3组于再灌注前5min分别腹腔注射14、28、56μmol·kg-1硫氢化钠。各组于再灌注6h抽取下腔静脉血样并取肝组织，采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性，采用二硫代二硝基苯甲酸法测定肝组织谷胱甘肽(GSH)含量，光镜下观察肝组织病理学变化。
　　结果：与Sham组相比，IR组血清ALT和AsT活性升高，肝组织GSH含量下降(P<0.05)：与IR组相比，H2S1～3组ALT和AST活性降低，肝组织GSH含量升高(P<0.05)；H2S1～3组肝病理学损伤较IR组明显减轻。
　　结论：硫化氢后处理可减轻大鼠肝缺血再灌注损伤。
　　二、ATP敏感性钾通道在硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用
　　目的：评价ATP敏感性钾通道在硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用。
　　方法：健康雄性SD大鼠30只，质量220～250g，采用随机数字表法分为5组(n=6)，假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、硫化氢组(NaHS组)、格列本脲组(Gli组)和5-羟基葵酸组(5-HD组)。Sham组仅暴露肝门，不夹闭动、静脉；IR组采用夹闭左、中叶肝蒂、门静脉和肝动脉支60min，然后松开夹闭恢复灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注模型；H2S组于再灌注前5min腹腔注射28μmol·kg-1硫氢化钠；Gli组于硫氢化钠给药前5 min腹腔注射非选择性ATP敏感性钾通道阻断剂格列本脲6 mg·kg-1，5-HD组于硫氢化钠给药前5 min腹腔注射选择性线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟基葵酸10mg·kg-1。各组于再灌注6h抽取下腔静脉血样并取肝组织，采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性，采用双抗体夹心ELISA法测定肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，采用比色法测定肝组织髓过氧化物酶(MPO)含量，光镜下观察肝组织病理学变化。
　　结果：与Sham组比较，IR组血清ALT和AST活性升高，肝组织TNF-α和MPO含量上升(P<0.01)；与IR组比较，H2S组血清ALT、AST活性和肝组织TNF-α、MPO含量降低(P<0.01)，肝病理学损伤减轻；与H2S组比较，Gli组和5-HD组血清ALT、AST活性和肝组织TNF-α、MPO含量升高(P<0.01)，肝病理学损伤加重。
　　结论：ATP敏感性钾通道的开放参与了硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤。
　　三、硫氧还蛋白系统在硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤中的变化
　　目的：通过评价硫氧还蛋白系统在硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤中的变化，探讨硫化氢后处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤的可能机制。
　　方法：健康雄性SD大鼠18只，质量220～250g，采用随机数字表法分为3组(n=6)，假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、硫化氢组(NaHS组)。S组仅暴露肝门，不夹闭动、静脉；IR组采用夹闭左、中叶肝蒂、门静脉和肝动脉支60min，再恢复灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注模型；H2S组于再灌注前5 min腹腔注射28μmol·kg-1硫氢化钠。各组于再灌注6h取肝组织，采用双抗体夹心ELISA法检测硫氧还蛋白酶(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性，采用Western-blot技术检测Trx系统蛋白和硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)表达。
　　结果：与Shmn组比较，IR组Trx活性下降和Trx1蛋白表达下调，TXNIP蛋白表达上调(P<0.05)；与IR组比较，H2S组Trx活性升高和Trx1蛋白表达上调，TXNIP蛋白表达下调(P<0.05)。
　　结论：硫化氢后处理可能通过抑制肝组织TXNIP的表达、增强肝组织Trx1表达和活性，增强组织的抗氧化能力，从而减轻大鼠肝缺血再灌注损伤。