环孢霉素A对人晶状体上皮细胞抑制的体外研究

摘要

目的：
　　 体外研究环孢霉素A(CsA)对人晶状体上皮细胞(HLEB-3)抑制，计算CsA对人晶状体上皮细胞的半数有效抑制浓度;定量测定PCNA基因在无CsA处理的对照组与CsA处理的实验组中的表达，进一步探讨CsA抑制人晶状体上皮细胞增殖的分子作用机制，验证CsA与PCNA阳性细胞表达量的关系，为CsA修饰的IOL体内实验提供依据。
　　 方法：
　　 体外培养来源于广州中山医科大学眼科中心的人晶状体上皮细胞株HLE B-3细胞。
　　 (1)细胞增殖实验的测定观察细胞增殖状态，实验设置10个细胞浓度梯度（0.125×104个/ml、0.25×104个/ml、0.5×104个/ml、1.0×104个/ml、1.5×104个/ml、2.0×104个/ml、2.5×104个/ml、3.0×104个/ml、3.5×104个/ml、4.0×104个/ml）。以2×104个/ml细胞密度种植96孔板，设置实验组与对照组，实验组给予CsA刺激，浓度为1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml，作用时间24h、48h、72h，对照组无CsA刺激，作用时间24h、48h、72h。每组设2个平行复孔，重复3次。
　　 (2)PCNA基因的表达测定以1×105个/ml的细胞密度接种于24孔板，实验组给予CsA刺激，浓度1ug/ml，作用24h、48h，对照组无CsA刺激，应用RT-PCR检测PCNA基因的复制;应用组织免疫学方法检测PCNA阳性细胞的表达。每组设2个平行复孔，重复3次。
　　 (3)RT-PCR结果应用2-ΔΔCT统计量进行分析，免疫组织化学结果分别应用PI及IPP.5.0图像分析法。所有统计学数据，应用SPSS19.0进行统计学分析，检验水准a=0.05。
　　 结果：
　　 (1)在低浓度时(1ug/ml) CsA作用24h对人晶状体上皮细胞的增殖抑制实验组与对照组差异不具有统计学意义(P＞0.05)，作用48h对细胞增殖抑制实验组与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05)。CsA作用24h，IC50=71.010±1.851μg/ml，Probit=-2.964+1.601x; CsA作用48h, IC50=25.529±1.407μg/ml,Probit=-1.363+1.969x; CsA作用72h, IC50=17.881±1.252μg/ml,Probit=-5.915+4.723x。CsA对HLEB-3细胞的抑制呈时间依赖性及浓度依赖性。
　　 (2)RT-PCR测定，CsA1ug/ml作用24h PCNA表达量实验组与对照组差异不具有统计学意义(P＞0.05)，作用48h PCNA表达量实验组与对照组差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 (3)免疫组织化学测定，CsA1ug/ml作用24h、48h PCNA阳性细胞在实验组与对照组中，作用24h差异不具有统计学意义(P＞0.05);作用48h差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论：
　　 (1)CsA1ug/ml作用24h，不能对HLE-B3增殖的抑制产生有效作用;在持续作用至48h时，CsA能够有效抑制HLEB-3细胞的增殖。CsA对HLEB-3细胞抑制呈时间依赖性;在有效抑制浓度(1ug/ml)下，CsA对HLEB-3的抑制呈浓度依赖性，其半数抑制率提高。
　　 (2)CsA能够抑制PCNA基因的表达，且呈时间依赖性。环孢霉素A能够抑制PCNA蛋白的表达，且呈时间依赖性。
　　 (3)CsA通过抑制抑制PCNA基因表达抑制HLEB-3细胞增殖。
　　 综上，CsA1ug/ml持续作用至48h，能有效抑制HLE B-3细胞的增殖，干预后发性白内障的形成，为防治后发性白内障的可行性药物。此结果将为CsA修饰的载药性人工晶状体的体内实验提供依据。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、环孢霉素A对人晶状体上皮细胞的有效抑制浓度

1．1 对象和方法

1．1．1 使用材料

1．1．2 HLEB-3的体外培养

1．1．3 实验方法

1．1．4 统计分析

1．2 结果

1．2．1 细胞传代培养

1．2．2 倒置相差显微镜观察

1．2．3 增殖测定

1．2．4 CsA作用于HLE-B3的IC50

1．3 讨论

1．3．1 后发性白内障的发病机制

1．3．2 CsA对人晶状体上皮细胞抑制的最小作用浓度

1．3．3 CsA的IC50

1．4 小结

二、PCNA在经过CsA处理后的HLEB-3细胞中的表达

2．1 实验对象和方法

2．1．1 使用材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 细胞培养

2．1．5 缓冲液配置

2．1．6 1％琼脂糖凝胶配置

2．1．7 实验方法

2．1．8 电泳

2．1．9 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 CsA对PCNA mRNA的表达具有抑制作用

2．2．2 免疫组化测HLE-B3中PCNA蛋白的表达

2．3 讨论

2．3．1 CsA作用机制

2．3．2 PCNA基因的表达

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 环孢霉素A对人晶状体上皮细胞的抑制的体外研究

致谢