蓝莓提取物改善阿尔茨海默病认知功能障碍的实验研究

摘要

目的：
　　 (1)评价APP/PS1双转基因AD小鼠模型效果，明确其发病进程和特点，为后续研究提供一种稳定的AD动物模型;(2)观察蓝莓提取物(Blueberryextracts，BB)干预对AD动物学习记忆损伤的作用，以及对Aβ诱导海马神经元损伤的拮抗作用;(3)探讨BB上述作用的可能机制。
　　 方法：
　　 AD转基因小鼠模型的建立:由两对APP/PS1小鼠繁育扩种，所繁殖的小鼠在40日龄时取鼠尾组织提取DNA，通过PCR扩增后琼脂糖电泳检测目标基因筛选出阳性小鼠;在7月龄时，分别对阳性小鼠和阴性小鼠进行Morris水迷宫实验测试，评价小鼠是否出现学习记忆能力损伤，之后取脑组织及海马组织进行HE染色和刚果红染色，观察是否出现类似AD的典型病理改变。
　　 BB改善AD学习记忆障碍的实验研究:(1)体外实验:培养新生大鼠海马原代神经元，设置正常对照组、Aβ组以及Aβ+不同浓度BB组，以BB预孵育24h后，再以5μmol/L Aβ25-35处理24h模拟AD损伤，MTT法检测各组神经元活力，并确定BB干预的有效剂量;(2)体内试验:根据基因型检测结果，将小鼠分成阴性对照（CT，溶剂对照）组、模型（AD，溶剂对照）组和模型干预(AD+BB，BB150mg/kg·bw)组。在小鼠3月龄时，对各组施加相应干预，持续16周，观察其外观变化，记录摄食量，Morris水迷宫试验评价学习记忆能力;之后处死小鼠，称量小鼠主要脏器重量并计算脏器系数;对脑皮层及海马组织进行病理检查，并计数凋亡、坏死神经元数目。
　　 BB改善AD学习记忆相关机制的探讨:分别从细胞水平和整体水平进行研究。实验分组及处理同上。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测MAPK/ERK信号通路分子ERK1/2、MEK2，甲基化酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3，脑源性神经营养因子(BDNF)和泛素羧基末端水解酶(UCH-L1)的mRNA表达;采用Western blotting检测ERK1/2、MEK2、DBDNF和UCH-L1蛋白的表达;检测小鼠脑组织及血清抗氧化防御系统功能，包括MDA、SOD、还原型GSH和GSH-Px;采用电生理学方法检测小鼠海马CA1区长时程增强(LTP)。分别从抗氧化、细胞信号转导、表观遗传学及突触可塑性的角度探索蓝莓神经保护作用的可能机制。
　　 结果：
　　 AD转基因小鼠模型的建立: Morris水迷宫检测结果显示，至7月龄时，APP/PS1小鼠定向航行试验需要耗费较长时间才能到达平台，对训练成果记忆稳定和牢固程度较差;空间探索试验结果显示，APP/PS1小鼠在目标象限区域的穿越次数明显少于正常对照小鼠，出现明显的学习记忆能力损伤。HE染色显示，7月龄的APP/PS1小鼠脑组织及海马CA1、CA3区均出现明显的神经元凋亡、变性，神经元减少;刚果红染色表明，阳性小鼠7月龄时脑组织已出现β淀粉样蛋白沉积斑块。
　　 BB改善AD学习记忆障碍的实验研究:(1)细胞实验显示，0.4μg/mlBB可以对抗Aβ损伤，提高神经元活力，而4μg/ml及以上浓度的BB反而影响细胞生长，抑制细胞活力，并且随浓度的增高，细胞活力下降程度与BB浓度之间呈现剂量依赖关系。(2)动物实验结果表明，BB干预可减轻AD模型小鼠老化的部分症状和体征，明显缩短AD小鼠在定向航行试验中的潜伏时间，增加在空间探索试验中的目标区域穿越次数，抑制大脑萎缩，病理检查发现BB还能减轻AD模型小鼠脑组织神经元凋亡、坏死程度。
　　 BB改善AD学习记忆相关机制的探讨:(1)体外实验:Aβ损伤可明显上调神经元ERK1/2、MEK2及三种HDAC的mRNA和蛋白的表达，同时抑制BDNF、UCH-L1的mRNA及蛋白的表达;BB干预后神经元ERK1/2、MEK2及三种HDAC表达上调的趋势得到明显抑制，而BDNF、UCH-L1的mRNA和蛋白表达明显增加。(2)动物实验:与CT组小鼠相比，AD小鼠脑组织中氧化损伤明显，BB可显著提高GSH-Px活性，升高还原型GSH，降低MDA水平。RT-PCR和Western blotting检测结果与细胞实验一致，AD小鼠脑组织ERK1/2、MEK2和三种HDAC表达明显增高，但是BDNF和UCH-L1的表达明显减少。BB干预可有效抑制ERK1/2和MEK2的过度激活，减少HDAC的表达，上调BDNF和UCH-L1的表达。电生理学检测也显示，BB可以显著增强AD小鼠海马CA1区LTP。体外及动物实验均未发现AD状态下以及实施蓝莓干预对甲基化酶的表达存在显著差异。
　　 结论：
　　 (1)该AD转基因小鼠模型繁殖阳性率较稳定，AD样病理及行为特征表现典型，是一种理想的AD动物模型;(2) BB具有拮抗Aβ损伤、保护神经元以及改善AD转基因小鼠学习记忆能力损伤的作用，但是BB可能存在安全剂量范围，过高的BB浓度对细胞生长可能存在不良影响。(3) AD发病可能通过加剧脑组织的氧化损伤、诱导MAPK/ERK信号通路相关蛋白的过度表达和活化、改变某些表观遗传学特征、影响神经突触相关蛋白的表达，对脑功能造成进行性的损伤;而BB可以有效拮抗AD过程中的氧化损伤，调节MAPK/ERK信号蛋白的异常表达和活化，抑制表观遗传的异常改变，增强突触可塑性，从而发挥其神经保护功能。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 AD转基因小鼠模型的鉴定与评价

1．1 材料和方法

1．1．1 动物分组

1．1．2 基因型鉴定

1．1．3 Morris水迷宫实验

1．1．4 病理学观察

1．1．5 数据统计与分析

1．2 结果

1．2．1 基因型鉴定

1．2．2 Morris水迷宫试验

1．2．3 病理学观察

1．2．4 脑皮层及海马CA1、CA3神经元计数

1．3 讨论

第二部分 蓝莓提取物改善AD学习记忆障碍的实验研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 细胞试验

2．1．5 动物实验

2．1．6 统计分析方法

2．2 结果

2．2．1 细胞实验

2．2．2 动物实验

2．3 讨论

2．4 小结

第三部分 蓝莓提取物改善AD学习记忆相关机制的探讨

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 细胞实验

3．1．4 动物实验

3．1．5 数据统计与分析

3．2 结果

3．2．1 细胞试验

3．2．2 动物实验

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 阿尔茨海默病实验模型在阿尔茨海默病研究中的应用

致谢