电压门控型钠通道中介的单核/巨噬细胞免疫调节在心肌缺血再灌注损伤中的作用

摘要

研究目的:炎症反应在心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤后的组织修复和心室重塑中发挥重要作用。抑制过度的炎症反应能够缩小心梗面积，改善心功能。单核/巨噬细胞是心肌组织损伤修复中驻留时间最长的炎症细胞。单核/巨噬细胞具有异质性:具有促炎症表型的细胞主要执行吞噬、趋化等作用;具有抑制炎症表型的细胞则能促进血管新生、胶原沉积和组织重塑。近年来的研究显示，促进单核/巨噬细胞由促炎症表型向分泌表型转化，将有助于加速组织修复。新近有研究显示，单核/巨噬细胞的电压门控型钠通道(voltage-gatedsodiumchannels，VGSCs/NaV)参与其生物表型的转化。本实验室的前期工作发现VGSCs阻断剂苯妥英钠(phenytoin，PHT)可促进巨噬细胞的旁分泌效应，并加速心肌梗死(myocardialinfarction，MI)后组织修复进程，提示VGSCs是调节单核/巨噬细胞生物表型的靶点之一。VGSCs在体内分布广泛，如神经系统、心肌细胞和骨骼肌细胞。脂质体是一种在药剂学和分子生物学研究中常用的药物/基因载体。经静脉注射的脂质体进入血液循环后，能在调理素的介导下被单核/巨噬细胞吞噬，且易在炎症区域富集，利用这一作用可以实现单核/巨噬细胞的靶向性给药。本课题的研究目的是探讨VGSCs阻断剂和激动剂对单核/巨噬细胞表型转化的影响，及脂质体包被的PHT对I/R损伤后组织修复和心室重塑的干预作用。
　　 研究内容与方法:研究内容分为细胞实验和动物实验两部分。细胞实验:以小鼠RAW264.7巨噬细胞系及Wistar大鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。利用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)检测巨噬细胞内VGSCs的表达情况，及将VGSCs阻断剂PHT、河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)和激动剂藜芦定(veratridine)作用于不同活化状态的巨噬细胞后表型标志物mRNA水平的表达情况。应用PCR和Westernblot方法检测NF-κB信号通路的mRNA水平及蛋白水平的表达情况。将RNA干扰(RNAinterference，RNAi)质粒（pGPU6/Neo-NaV1.9-shRNA）转染进RAW264.7，经G418筛选获得稳定细胞株。对稳定细胞株进行如下检测:PCR鉴定干扰效率;CCK-8法测定增殖活性;流式细胞术检测细胞周期及吞噬能力;transwell小室法检测细胞的迁移功能;PCR检测巨噬细胞标志物的mRNA水平的表达情况。动物实验:以雄性Wistar大鼠为研究对象。薄膜分散法制备PHT脂质体(PHT-lipo)，高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)测定PHT-lipo在大鼠体内药代动力学。Wistar大鼠随机分为缺血再灌注组（I/R组）和假手术组（Sham组）。每组又分为三个亚组，于手术后即刻、第2、4d经静脉注射给予生理盐水(saline)，空白脂质体(Emp-lipo)或PHT-lipo。I/R模型采用左冠状动脉结扎法，缺血45min然后持续再灌注。Sham组为穿线不结扎。于术前、术后1、3、5、7、14、30d抽取大鼠尾静脉血，运用流式细胞术检测大鼠循环中单核细胞CD43+和CD43++两个亚群各时间点的比例。术后第30d采用超声心动图和血流动力学评价心脏功能。随后处死动物，留取心脏标本进行病理染色。Masson染色检测心肌梗死面积、膨展指数、胶原容积分数。麦胚凝集素(wheatgermagglutinin，WGA)检测心肌横断面积。IsolectinB4染色检测毛细血管密度。
　　 结果:细胞实验:1）RAW264.7中有表达的VGSCsα亚基有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.9和NaVX。2）应用PHT之后，能使未诱导RAW264.7的M1型标志物CCL5、TNF-α及NOS2表达明显降低，使经脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7的M1型标志物IL-1β、CCL2、CCL5及TNF-α表达降低。TTX能降低未诱导RAW264.7的M1型标志物IL-1β和CCL5表达，降低经LPS诱导RAW264.7的M1型标志物CCL2、CCL5及TNF-α表达。应用藜芦定之后，能使经白介素-4（interleukin-4，IL-4）诱导RAW264.7的M2型标志物Arg1表达降低。3）LPS激活NF-κB信号通路，VGSCs阻断剂能抑制其激活，激动剂则能促进IL-4诱导后的活化。4）成功建立稳定干扰NaV1.9的细胞株，RT-PCR法鉴定干扰效率约80％。下调NaV1.9的表达使RAW264.7的增殖活性、吞噬能力和迁移功能显著降低，M1型标志物CCL5、NOS2表达降低，M2型标志物Arg1、mannose表达升高，NF-κB的表达也降低。5）大鼠腹腔巨噬细胞中有表达的VGSCs是:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaVX、Scn1b、Scn3b和Scn4b。PHT抑制LPS引起的M1型巨噬细胞标志物TNF-α、CCL5表达的升高，促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志物Arg1、TGF-β1的表达。动物实验:1）大鼠尾静脉注射给药后，大鼠体内的PHT和PHT-lipo的血药浓度-时间曲线均符合二室模型。PHT-lipo组的T1/2α（分布半衰期）及T1/2β（清除半衰期）均短于PHT组，AUC略低于PHT组。2）单核细胞亚群在大鼠心肌缺血再灌注模型中存在动态改变:与基线相比，I/R-Saline组CD43+细胞比例从术后第1d开始升高，在第3d达到高峰，之后逐渐下降，在第7d基本恢复基线水平;Sham-Saline组CD43+细胞比例在术后第1d亦明显升高，但在术后第3d已降至基线水平。与Sham-Saline组相比，I/R-Saline组术后第3dCD43+细胞比例显著性升高，其余时间点则无显著性差异。CD43++单核细胞呈现与CD43+细胞相反的变化趋势。3）PHT-lipo能够抑制心肌损伤早期外周血CD43+单核细胞比例的升高，缩小心肌梗死面积，促进梗死区毛细血管增生，降低梗死区胶原沉积和非梗死区代偿性心肌肥大，抑制心室扩张，并改善左心室功能。
　　 结论:阻断细胞内VGSCs活性可以促使巨噬细胞向M2型转化。VGSCs阻断剂通过降低I/R损伤早期CD43+单核细胞比例改善心室重塑和心功能。本研究结果有助于深入阐释VGSCs中介的单核/巨噬细胞免疫调节作用在I/R后组织修复过程中的病理生理学作用，为以单核/巨噬细胞为靶点的I/R损伤后心室重塑干预策略提供了新的实验依据。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、电压门控型钠通道对巨噬细胞表型偏移的影响

1．1 对象和方法

1．1．1 细胞系及原代细胞

1．1．2 主要试剂

1．1．3 试剂配制

1．1．4 主要仪器及耗材

1．1．5 RAW264．7细胞中VGSCs表达情况的检测

1．1．6 不同诱导剂及药物对小鼠RAW264．7巨噬细胞系表型标志物的影响

1．1．7 NF-κB信号通路在巨噬细胞表型偏移中的影响

1．1．8 干扰NaV1．9对RAW264．7细胞增殖、吞噬、迁移及表型标志物的影响

1．1．9 大鼠腹腔巨噬细胞VGSCs表达水平检测

1．1．10 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 RAW264．7中VGSCs的表达情况

1．2．2 不同诱导剂及药物对小鼠RAW264．7巨噬细胞表型标志物mRNA表达水平的影响

1．2．3 NF-κB信号通路在巨噬细胞表型偏移中的影响

1．2．4 干扰NaV1．9对巨噬细胞增殖、吞噬、迁移能力及表型标志物的影响

1．2．5 大鼠腹腔巨噬细胞VGSCs表达情况的检测

1．2．6 不同诱导剂及药物对大鼠腹腔巨噬细胞表型标志物mRNA表达水平的影响

1．3 讨论

1．3．1 巨噬细胞的经典激活和替代性激活

1．3．2 VGSCs的表达存在种属和组织特异性

1．3．3 VGSCs参与免疫细胞功能的调控

1．3．4 NF-κB信号转导通路参与巨噬细胞表型转化的调节

1．4 小结

二、苯妥英钠脂质体的制备及大鼠体内药代动力学研究

2．1 对象和方法

2．1．1 实验动物及分组

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器及耗材

2．1．4 PHT-lipo的制备

2．1．5 PHT-lipo包封率的测定

2．1．6 PHT-lipo其他基本性状检测

2．1．7 PHT-lipo在大鼠体内的药代动力学检测

2．1．8 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 PHT-lipo的基本性状

2．2．2 PHT-lipo大鼠体内药代动力学研究

2．3 讨论

2．3．1 脂质体是一种高效的药物载体

2．3．2 PHT-lipo的单核／巨噬细胞靶向性给药的实现

2．4 小结

三、苯妥英钠对心肌缺血再灌注损伤后心室重塑的调节作用

3．1 对象和方法

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 试剂配制

3．1．4 主要仪器和耗材

3．1．5 大鼠I／R模型的建立

3．1．6 大鼠尾静脉注射给药

3．1．7 流式细胞术检测外周血单核细胞不同亚群比例

3．1．8 大鼠超声心动图检测

3．1．9 大鼠有创血流动力学检查

3．1．10 动物组织的取材与处理

3．1．11 Masson染色

3．1．12 WGA染色

3．1．13 Isolectin B4染色

3．1．14 病理图片分析

3．1．15 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 大鼠I／R模型的成功建立

3．2．2 流式细胞术单核细胞亚群设门方法的建立

3．2．3 大鼠外周血单核细胞亚群的动态变化

3．2．4 PHT-lipo降低心梗面积、胶原容积分数及心室膨展指数

3．2．5 PHT-lipo减小I／R组室间隔区域的心肌横断面积

3．2．6 PHT-lipo增加I／R后梗死周边区毛细血管密度

3．2．7 超声心动图分析心脏功能

3．2．8 血流动力学分析心脏功能

3．3 讨论

3．3．1 PHT-lipo调节外周血单核细胞亚群动态变化

3．3．2 PHT-lipo改善I／R损伤的预后

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 巨噬细胞的激活及调控机制研究进展

致谢