pre-B细胞中CTCF介导沉默子Sis和增强子Ei相互作用并抑制VJ重排

摘要

真核细胞基因表达的精确调控需要顺势调控元件之间以及顺式调控元件和启动子之间发生直接的相互作用，这种相互作用使得基因在特定的状态下呈现特定的染色质高级结构。小鼠免疫球蛋白轻链kappa(Igκ)基因是研究细胞分化过程中染色质高级结构变化的理想模型。Igκ基因包含95个功能Vκ基因，4个功能Jκ基因，以及一个Cκ基因。目前已发现的Igκ基因顺式调控元件包括沉默子Sis，位于内含子区域的增强子(Ei)，3'增强子(E3')和下游增强子(Ed)。前B细胞（pre-B细胞）中，Vκ基因带着自身启动子半随机地重排到任意的Jκ区域，并起始转录。Sis和Ei具有调节VJ重排的功能，Sis通过将Igκ基因定位到异染色质抑制VJ重排，而Ei通过促进“germline transcription”促进VJ重排。
　　 CCCTC位点结合蛋白CTCF具有高度保守的锌指结构，并在基因表达调控中有重要作用，如调控基因活化和沉默，参与基因印记等。此外CTCF还能介导形成染色质内部及染色质之间的相互作用。有报道推测在pre-B细胞中CTCF结合在Sis上，然而CTCF是否介导Igκ基因的染色质高级结构，是否调控VJ的重排依然不是很清楚。
　　 通过染色质构象捕获技术(3C)我们发现在pre-B细胞中Sis与Ei之间发生直接的相互作用，Igκ基因形成一个染色质环，而在pro-B细胞中则不存在这种直接的相互作用。通过shRNA下调CTCF的表达，我们发现Ei-Sis之间的相互作用消失，同时“germline transcription”增强，VJ重排增强。这些结果说明CTCF是介导Ei-Sis相互作用的关键蛋白，而增强子和沉默子之间的相互作用能够抑制增强子的功能。因此，我们认为CTCF通过介导Sis与Ei之间的相互作用，抑制了“germline transcription”进而抑制VJ重排，参与等位基因互斥调控中的单等位基因沉默效应。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1．对象和方法

1．1 染色质构象捕获技术对象和方法

1．1．1 染色质构象捕获技术实验材料

1．1．2 染色质构象捕获技术的原理

1．1．3 染色体构象捕获技术流程

1．1．4 染色体构象捕获技术对照实验的设立

1．2 染色体免疫共沉淀技术对象和方法

1．2．1 染色体免疫共沉淀技术实验材料

1．2．2 染色体免疫共沉淀技术的原理

1．2．3 染色体免疫共沉淀(ChIP)技术流程

1．3 shRNA下调CTCF表达技术对象和方法

1．3．1 shRNA下调CTCF表达技术实验材料

1．3．2 shRNA质粒的构建

1．3．3 iCTCF-shRNA慢病毒的产生和70Z／3细胞的感染

1．3．4 Western Blot检测CTCF的基因沉默水平

1．4 Igκ基因重排实验对象和方法

1．4．1 Igκ基因重排实验材料

1．4．2 细胞总RNA的提取及Real-time PCR检测

1．4．3 PCR检测Vκ基因的重排

2 结果

2．1 Sis和Ei仅在pre-B细胞中存在相互作用

2．1．1 3C实验对照的设立

2．1．2 pro-B细胞38B9中Sis和Ei不存在相互作用

2．1．3 pre-B细胞70Z／3中Sis和Ei存在相互作用，形成染色质环

2．2 在70Z／3细胞中CTCF结合于Sis片段

2．3 shRNA质粒的构建

2．3．1 pSPR-iCTCF质粒的鉴定

2．3．2 277-iCTCF质粒的鉴定

2．4 70Z／3细胞中CTCF下调后，Sis与Ei相互作用消失

2．5 CTCF通过抑制Igκ基因germline的转录从而抑制VJ的重排

3．讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 染色体高级构象在V(D)J重排中的作用

致谢