晶状体上皮细胞光损伤与活性氧作用及TGF-β2/Smad3信号传导通路的研究

摘要

目的:白内障是全世界首位的致盲性眼病，虽然不同的损伤因子导致白内障的通路和机制各不相同，但是它们大多通过一共同的中间产物——活性氧，累积的光暴露诱发的活性氧自由基所导致的晶状体上皮细胞凋亡与老年性白内障的发生关系密切，另外TGF-β2/Smad3信号传导通路与白内障及晶状体上皮细胞凋亡之间的关系得到越来越多的关注。本研究采用发光二极管(light emitting diode，LED)光源制作晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)光损伤模型，探讨LEC光损伤与活性氧和TGF-β2/Smad3信号传导通路之间的关系，本研究进一步观察了具有活性氧清除作用的丹参素和阻断TGF-β2/Smad3信号传导通路对LED光源诱导人晶状体上皮细胞光损伤所致凋亡的影响，进一步评价了活性氧和TGF-β2/Smad3信号传导通路在以上过程中的作用。
　　方法:本研究包括三部分:1.使用LED光源20000勒克斯照度0h、6h、12h、24h照射LEC，使用流式细胞术检测LEC内活性氧的表达及细胞凋亡情况，分别使用Real-time PCR和Western blotting检测BAX和TGF-β2mRNA和蛋白表达，使用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖。2.在第一部分基础上，使用具有活性氧清除功能的丹参素，观察丹参素光照组和光照组LEC在LED光源20000勒克斯照度照射24h后，细胞内活性氧的表达、细胞凋亡率、BAX基因和BAX蛋白表达等各项指标的差异。3.以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体，构建Smad3的siRNA表达质粒，转化大肠杆菌、酶切、测序进行鉴定，利用siRNA阻断Smad3信号传导通路后，观察其与对照组在LED光源20000勒克斯照度照射24h后，细胞凋亡率、BAX基因和BAX蛋白表达等各项指标的差异。
　　结果:1.光照0h组、6h组、12h组、24h组LEC内活性氧平均荧光强度、早期凋亡率、总凋亡率随光照时间的延长逐渐上升，且各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。光照6h、12h、24h组，BAX的mRNA表达较0h组分别升高约1.45倍、5.45倍和15.86倍， TGF-β2的mRNA表达分别升高约1.22倍、1.79倍和4.01倍，各组间表达差异有统计学意义(P＜0.05)。光照24h组BAX和TGF-β2蛋白的表达量分别较0h组升高约1.85倍和2倍。MTT实验0h组和24h组在570nm处的吸收值分别为0.991±0.014和0.858±0.032，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。2.光照组和丹参素光照组ROS平均荧光强度分别为15.83±5.81和7.67±0.63，两组间差异具有统计学意义(t=2.882，P=0.034)。光照组和丹参素光照组HLEB-3细胞总凋亡率分别为5.22％±1.63％和1.57％±1.21％，两组间差异有统计学意义(t=3.11P=0.036)。光照组BAX基因的表达水平是丹参素光照组的9.51±3.23倍，两组间差异有统计学意义（t=-4.566，P=0.010）。光照组、对照组和丹参素光照组BAX蛋白条带的校正后灰度值分别为0.297、0.065和0.100。MTT实验光照组、对照组和丹参素光照组，在570nm处的吸收值A570分别为1.002±0.017、1.230±0.025、1.116±0.033，三组间比较差异有统计学意义（F=57.028，P＜0.0001），且每两组之间比较差异均有统计学意义P＜0.05）。3.转染Smad3 siRNA光照组、转染空载体光照组总凋亡率分别为2.04％±1.03％和5.80％±1.12％，两组间差异有统计学意义(t=-4.298，P=0.013)。光照组BAX基因表达是转染Smad3 siRNA光照组的2.36±0.57倍，两组间差异有统计学意义（t=-4.111，P=0.015）。转染空载体光照组BAX基因的表达是转染Smad3 siRNA光照组的3.10±0.76倍，两组间差异有统计学意义(t=-4.804，P=0.041)。转染Smad3 siRNA光照组、转染空载体光照组、光照组、对照组BAX蛋白条带的校正后灰度值分别为0.193、0.586、0.283、0.036。
　　结论:1.随光照时间的延长LEC活性氧含量、早期凋亡率、总凋亡率、BAX基因和蛋白表达、TGF-β2基因和蛋白表达升高，细胞增殖活性下降。TGF-β2可能参与了光诱导的LEC的活性氧损伤和细胞凋亡的过程。2.丹参素可以明显降低光损伤诱导的人晶状体上皮细胞内的活性氧水平，降低细胞凋亡的发生，丹参素对于光诱导的晶状体上皮细胞损伤的保护作用可能是通过抑制细胞内活性氧的产生来实现的。3.TGF-β2/Smad3信号传导通路参与了LED光源诱导的人晶状体上皮细胞光损伤所导致的细胞凋亡的过程，且阻断其作用对LED光源光损伤诱导的细胞凋亡有一定的抑制作用。

目录

声明

摘要

缩略语说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 LED光源诱导人晶状体上皮细胞光损伤模型的建立

1．1 对象和方法

1．1．1 细胞系

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要仪器

1．1．4 实验方法

1．2 结果

1．2．1 光镜下细胞形态观察及荧光显微镜下细胞ROS荧光观察

1．2．2 流式细胞术细胞内ROS荧光检测

1．2．3 流式细胞术凋亡检测

1．2．4 Real-time PCR检测

1．2．5 Western印记检测

1．2．6 MTT检测

1．3 讨论

1．4 小结

第二部分 丹参素对LECs光损伤影响的研究

2．1 对象和方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验方法

2．2 结果

2．2．1 丹参素对HLEB-3细胞保护作用浓度筛选

2．2．2 光镜下细胞形态观察及荧光显微镜下细胞ROS荧光观察

2．2．3 流式细胞术细胞内ROS荧光检测

2．2．4 流式细胞术凋亡检测结果

2．2．5 Real-time PCR检测

2．2．6 Western印记检测

2．2．7 MTT检测丹参素对LED光源光损伤HLEB-3细胞增殖的影响

2．3 讨论

2．4 小结

第三部分 TGF-β2／Smad3信号传导通路在LECs光损伤中的作用

3．1 对象和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 Smad3 siRNA重组质粒的鉴定

3．2．2 Western bolt检查细胞在转染Smad3 siRNA后Smad3蛋白的表达情况

3．2．3 流式细胞术凋亡检测结果

3．2．4 Real-time PCR检测

3．2．5 Western印记检测

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 TGF-β／SMAD信号传导通路与白内障发生发展关系的研究进展

致谢