前列环素对原代培养的背根神经节细胞作用的实验研究

摘要

目的:1、通过一种无血清培养法培养高纯度的背根神经节神经细胞，为神经系统疾病的实验研究奠定基础。2、通过应用iloprost对培养的背根神经节神经细胞进行干预，观察iloprost对神经细胞轴突生长能力的影响。3、应用iloprost对培养的背根神经节神经细胞进行干预，观察其对阿霉素诱导的细胞凋亡的作用，为临床的慢性脊髓损伤后的修复研究寻求新的方法。
　　方法:1、选取新生24小时内SD乳鼠作为取材对象，显微镜下取出背根神经节，0.25％的胰酶进行消化，接种在0.2mg/ml多聚赖氨酸包被处理的培养板内，用含浓度为100μ g/ml神经生长因子(NGF)、2％B27添加剂、0.1mg/mlL谷氨酰胺，1％青链霉素的Nuerobasal培养基培养，培养48小时后全量换液，用含5μmol/L阿糖胞苷的培养基进行纯化培养48小时，此后每2天全量换液，取培养第5天的DRG细胞进行NSE免疫组织化学染色进行细胞鉴定。2、将取出的背根神经节进行不同的处理后，分别进行组织块培养和悬浮细胞培养。组织块培养:将DRG用0.25％胰蛋白酶消化5分钟，制均匀的组织块，分散接种在用多聚赖氨酸包被处理的6孔塑料细胞培养板中，然后分成A组和B组培养，A组应用含iloprost终浓度为20ng/ml的培养基培养，B组用不含iloprost的培养基培养，观察比较两组第3、5天时组织块周围突起数量、突起长度及最长突起长度。细胞培养:按照方法1中的步骤进行DRG取材、接种，然后分成C组和D组培养，C组应用含iloprost终浓度为20ng/ml的培养基培养，D组用不含iloprost的培养基培养，观察比较两组第3、5、11天时细胞突起数量、突起长度及最长突起长度。3、按照方法1中的步骤进行DRG取材、接种，然后分成A、B和C三组培养，A组按方法1中步骤培养，B组用不含iloprost的培养基培养，C组用含iloprost终浓度为20ng/ml的培养基培养。用配置好的含阿霉素(ADM)终浓度为5mg/L的反应液对培养5天后的B组和C组细胞进行损伤处理4h。对三组进行TUNEL染色处理，显微镜下观察细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。
　　结果:1、悬液细胞主要以神经细胞、雪旺细胞和成纤维细胞为主。刚接种的细胞均呈圆形，4h后细胞即开始贴壁，培养24h，可见大部分细胞贴壁牢固，细胞开始长出突起，突起细长，并可观察到突起末端的生长锥。用含阿糖胞苷的培养基培养48小时后，可见细胞数目明显减少，但神经细胞突起的主干和分枝明显延长并增粗，神经突起网络变得更加稠密，神经细胞胞体逐渐增大，细胞从球形变为多种形态后，形态保持相对稳定。细胞免疫组织化学染色显示，显色细胞大部分为阳性细胞，细胞质被染成棕黄色。纯度检测结果显示，培养7天后的神经细胞纯度可达90％左右。2、在组织块培养的第3、5天，iloprost干预组（A组）中组织块周围突起数目、突起长度和最长突起长度均较非干预组(B组)有明显增长，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。在细胞培养的第3、5、11天，iloprost干预组（C组）中细胞突起数目、平均突起长度和最长突起长度均较非干预组（D组）有明显增长，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、在A、B、C三组中均可发现不同程度的细胞凋亡现象，在无iloprost处理组（B组）中细胞凋亡现象最明显，细胞凋亡率最高(62.81±5.04)％，C组凋亡率次之(54.78±5.12)％，A组凋亡率最低(0.44±0.03)％;ADM处理组(B和C组)细胞凋亡率与非ADM处理组（A组）比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。iloprost干预组(C)细胞凋亡率与非iloprost干预组（B组）比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:1、通过对24小时新生SD乳鼠取材，采用无血清培养基培养，培养48小时加入阿糖胞苷的方法可明显抑制非神经细胞的生长，获得高纯度的DRG神经细胞。2、前列环素能够提高组织块及培养细胞轴突的生长能力，其对神经细胞的作用，不仅仅是改变局部血流，增加局部神经营养因子，而且本身还是一种神经营养因子。它通过与细胞膜上相应受体结合，提高细胞内cAMP水平，从而激活一系列生化反应，促进轴突的生长。3、通过浓度为5mg/L阿霉素(ADM)反应液损伤处理4h可诱导背根神经节细胞凋亡，前列环素可抑制细胞凋亡，可能通过升高cAMP后激活CREB，上调BcL-2途径而抑制凋亡。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、新生大鼠背根神经节细胞的纯化培养

1．对象和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 光镜下形态学观察

2．2 细胞免疫化学染色及纯度测定(NSE)

3 讨论

4 小结

二、前列环素对神经细胞轴突的作用

1．对象和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

3 讨论

3．1 神经细胞轴突再生

3．2 神经轴突再生与cAMP

3．3 前列环素与cAMP

4．小结

三、前列环素对神经细胞凋亡的作用

1．对象和方法

1．1 材料

1．2．方法

2．结果

3．讨论

3．1 细胞凋亡概述

3．2 细胞凋亡检测

3．3 凋亡模型的建立

3．4 前列环素与凋亡

4．小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 前列环素在慢性脊髓损伤修复中的研究进展

致谢