HGF单克隆抗体的制备及HGF ScFv单链抗体的制备

摘要

目的:
　　肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)是一种旁腺体分泌多功能多效性的细胞因子，主要在肝脏中产生，通过与c-MET受体结合在肿瘤中发挥多种作用，能增加趋化运动和促进恶性肿瘤的生长。本研究利用抗体工程技术制备HGF鼠单克隆抗体和HGF单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)，耦合微纳米材料悬臂梁器件，力求开发出肝癌患者早期血清学诊断的有效试剂盒。
　　方法:
　　1.用本课题组表达纯化的融合蛋白HGF免疫Balb/c小鼠，从而得到能分泌HGF的B细胞。
　　2.用细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，用ELISA法筛选具有分泌功能的单克隆抗体。
　　3.用ELISA法，Western Blotting方法对筛选出的单克隆抗体进行功能性验证，应用HiTrap Protein G HP柱纯化抗体。
　　4.应用夹心ELISA法将HGF单克隆抗体用于HCC患者血清的检测，以及用于悬臂梁纳米器件的连接。
　　5.用PCR法克隆出HGF单抗的重链轻链可变区以及Overlap PCR法连接重链和轻链可变区。
　　6.用重组技术构建Payz-HGF ScFv质粒，在大肠杆菌16C9中大量表达，应用HitrapFF亲和层析柱纯化HGF ScFv抗体。
　　结果:
　　1.HGF融合蛋白的免疫效果良好，血清学效价达到1∶16000。
　　2.筛选出3株HGF单克隆抗体，分别是HGF H-1(IgG2b)，HGF H-2(IgG2a)，HGF H-3(IgG1)。
　　3.HGF H-1(IgG2b)，HGF H-2(IgG2a)能很好应用于ELISA和Western Blotting对HGF的检测。制备得到HGF H-1、HGF H-2分别为7mg和8mg。
　　4.用biotin成功标记了HGF H-1，应用夹心法ELISA法检测30例HCC患者血清和30例正常人血清，差异明显。
　　5.HGF H-1成功耦合在悬臂梁纳米器件，初步得出对HGF的检测限为0.76pg。
　　6.构建了Payz-HGF ScFv质粒，表达纯化得到HGF ScFv抗体15mg。
　　结论:
　　1.本研究制备了三株针对细胞因子HGF的鼠单克隆抗体，抗体亚型分别为IgG2a, IgG2b, IgG1。
　　2.本研究初步建立了HGF单克隆抗体夹心法ELISA检测试剂盒，并且将抗体用于微纳米悬臂梁器件的耦合。
　　3.本研究制备了HGF ScFv抗体。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．1 实验材料

1．2 所需主要试剂及溶液的配制

1．3 主要仪器设备

1．4 实验方法

结果

2．1 抗HGF鼠单克隆抗体的制备

2．2 抗HGF鼠单克隆抗体的纯化

2．3 抗HGF鼠单克隆抗体的纯度

2．4 抗HGF鼠单克隆抗体效价的测定

2．5 抗HGF鼠单克隆抗体的应用

2．6 ScFv HGF单链抗体的制备

讨论

3．1 HGF单克隆抗体的制备及应用

3．2 HGF单克隆抗体的制备及性质的鉴定

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 单克隆抗体及单链抗体的应用

致谢