巨噬细胞中表皮生长因子受体激活对细胞因子及实验性结肠炎的调节作用

摘要

巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，在免疫调节中充当重要角色。很多研究从巨噬细胞活化及调节细胞因子分泌、迁移等角度，研究肠道炎症的发病机理。表皮生长因子(EGF，epidermal growth factor)信号通路激活后可促进细胞生长，但是巨噬细胞中EGF信号通路的作用尚未阐明。本课题组一直从事肠道炎症中EGF信号通路作用的基础研究。本课题即在前期研究的基础上，探索巨噬细胞中EGF受体(EGFR，epidermal growth factor receptor)激活对细胞因子及肠道炎症的调节作用。
　　本课题研究分为以下三个部分:
　　第一部分，首先在体外实验中证明了在巨噬细胞中抑制EGFR激酶活性能够上调脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）和干扰素-γ（IFN-γ，interferon-γ）刺激下的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)和白介素-10(IL-10)的表达，其与p38及核因子-κB(NF-κB)表达增加相关。其次在巨噬细胞EGFR表达缺陷小鼠模型中，发现巨噬细胞中敲除EGFR能够上调LPS刺激的炎性细胞因子表达。
　　第二部分，利用葡聚糖硫酸钠(DSS，dextran sulfate sodium)诱发的小鼠结肠炎模型，发现巨噬细胞中敲除EGFR能够促进结肠炎缓解并增强组织修复。在炎症急性期和修复期中，巨噬细胞中敲除EGFR后对TNF-α和IL-10具有不同的调节作用。随后验证了在巨噬细胞EGFR表达缺陷小鼠模型中，IL-10参与介导了EGFR对巨噬细胞免疫应答的调节作用，巨噬细胞EGFR表达缺陷小鼠与对照组相比，IL-10表达水平在结肠炎急性期及恢复期均持续增加，而TNF表达水平在急性期增加，在恢复期减少，Anti-IL-10中和抗体能够消除上述作用。可见IL-10能够抑制TNF生成，从而对巨噬细胞EGFR表达缺陷小鼠DSS结肠炎起到保护作用。
　　第三部分，在巨噬细胞EGFR表达缺陷小鼠DSS结肠炎中，发现结肠上皮细胞增殖增加，组织中ki67阳性细胞增加，同时结肠巨噬细胞中及结肠组织中环氧合酶-2-cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA水平增加。利用免疫荧光法检测溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患者结肠镜活检标本，发现EGFR磷酸化水平及人巨噬细胞标志物CD68表达水平增加。
　　综上所述，可以得出如下结论:在巨噬细胞中敲除EGFR后能够增加致炎细胞因子TNF及抗炎细胞因子IL-10的生成，IL-10生成增加会抑制TNF的生成，从而对肠道炎症起到保护作用。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

一、巨噬细胞EGFR活性对炎性细胞因子的影响

1．1 对象和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 RAW 264．7小鼠巨噬细胞培养

1．1．3 动物饲养

1．1．4 Egfrfl／flLysM-Cre小鼠培育

1．1．5 Egfrfl／flLysM-Cre小鼠基因分型鉴定

1．1．6 小鼠给药处理

1．1．7 小鼠腹腔提取巨噬细胞体外培养

1．1．8 小鼠结肠组织提取上皮细胞

1．1．9 小鼠外周血提取PBMC、PMN细胞，脾脏提取淋巴细胞

1．1．10 Western blot

1．1．11 ELISA法检测TNF

1．1．12 ELISA法检测IL-10

1．1．13 统计学方法

1．2 结果

1．2．1 体外抑制巨噬细胞EGFR活性上调由LPS／IFN-γ刺激的细胞因子水平

1．2．2 小鼠巨噬细胞敲除EGFR基因上调LPS刺激的细胞因子表达水平

1．3 讨论

1．3．1 IBD的病因

1．3．2 EGFR信号通路作用机制

1．3．3 TLR／MyD88信号通路作用机制

1．4 小结

二、巨噬细胞EGFR活性在DSS小鼠结肠炎模型中的调节作用

2．1 对象和方法

2．1．1 小鼠结肠组织提取巨噬细胞

2．1．2 免疫荧光染色

2．1．3 小鼠结肠炎病理分析

2．1．4 小鼠结肠组织MPO活性测定

2．1．5 小鼠结肠组织及结肠巨噬细胞Real-Time PCR

2．1．6 统计学方法

2．2 结果

2．2．1 巨噬细胞中敲除EGFR促进DSS诱导的小鼠结肠炎缓解并增强组织修复

2．2．2 炎症急性期和修复期巨噬细胞敲除EGFR后对细胞因子表达的差异性调节

2．2．3 在Egfrfl／flLysM-Cre小鼠中IL-10介导受EGFR调节的巨噬细胞免疫应答

2．3 讨论

2．3．1 DSS诱导结肠炎的机制及表现

2．3．2 肠道粘膜巨噬细胞的来源、分布及形态

2．3．3 巨噬细胞的表面标志物及表型

2．3．4 IBD肠道巨噬细胞的激活

2．3．5 IBD与炎性细胞因子的关系

2．3．6 巨噬细胞中EGFR活化对炎性细胞因子的影响

2．4 小结

三、巨噬细胞EGFR活性对小鼠结肠上皮细胞再生的影响

3．1 对象和方法

3．1．1 小鼠结肠组织ki67免疫组化染色

3．1．2 溃疡性结肠炎患者结肠镜活检标本免疫荧光染色

3．1．3 统计学方法

3．2 结果

3．2．1 Egfrfl／flLysM-Cre小鼠结肠上皮细胞再生能力增强

3．2．2 溃疡性结肠炎患者结肠巨噬细胞中EFGR激活增加

3．3 讨论

3．3．1 EGFR对LPS诱导的COX-2表达的影响

3．3．2 EGFR对TNF诱导的COX-2表达的影响

3．3．3 巨噬细胞敲除EGFR后对COX-2表达的影响

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 巨噬细胞在炎症性肠病及其相关肿瘤中免疫调节机制研究进展

致谢