微流控芯片技术分析慢性粒细胞白血病患者粒细胞髓过氧化物酶的表达

摘要

目的:慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一种骨髓增殖性血液疾病，死亡率逐年增加，我国已经上升到第3位。CML的诊断、分类以及预后评价等，一直按照WHO所提出的形态学、细胞遗传学的标准。但是对于慢性粒细胞白血病早期的患者，由于其原始粒细胞、早幼稚粒细胞与正常细胞形态差异并不特别明显。因此，应用形态学诊断其准确性有一定的降低。随着单细胞分析技术的不断发展，证实单个细胞中化学组分的种类或某一组分的含量会随着细胞的不同状态而产生变化。有研究指出髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)与许多疾病的发生相关。但是，MPO是否与慢性粒细胞白血病之间存在某种关系，目前尚不明确。本研究旨在设计出一种能够对单个中性粒细胞进行分析的微流控芯片，探讨中性粒细胞中MPO含量和活性的变化与慢性粒细胞白血病之间的对应关系，以期能够指导CML的早期诊断。
　　方法:
　　(1)收集CML患者95例，分别采集静脉血和骨髓穿刺液。健康对照组50例，分别采集静脉血。
　　(2)利用SYSMEX XE-2100血液分析仪，测定血液RBC数量、WBC数量、Hb含量和PLT数量。
　　(3)制备血液和骨髓涂片，利用瑞氏染液对造血细胞进行染色，依据细胞形态学对各种类型血细胞进行分类计数，计算各系统幼稚与成熟细胞及骨髓瘤细胞的数量。
　　(4)利用联苯胺法对细胞中的髓过氧化物酶进行染色，计算相对酶活性。
　　(5)设计一种能够进行单细胞分析的微流控芯片。
　　(6)利用设计出的芯片，对CML患者和对照组的中性粒细胞进行单细胞分析，测定髓过氧化物酶的相对表达情况。
　　(7)探讨几种重要因素的影响作用
　　结果:
　　第一部分应用一般方法检查慢性粒细胞白血病及髓过氧化物酶的情况
　　(1)血细胞分析仪检查的结果95例患者血常规检查结果:白细胞:10×109/L以下者2例，(20-50)×109/L者11例，平均42.1×109/L;(50-100)×109/L者27例，平均88.3×109/L;(100-300)×109/L者50例，平均197.5×109/L;300×109/L以上者15例，平均499.1×109/L;血红蛋白:（91-115）g/L（轻度贫血）者27例;（61-90）g/L（中度贫血）者42例;（31-60）g/L（重度贫血）者15例;(115-150) g/L（正常）者11例;血小板:＜120×109/L者16例;＞350×109/L者20例;(120-350)×109/L（正常）者59例;嗜酸性粒细胞:＞8％者62例;嗜碱性粒细胞:＞1％者59例;中性粒细胞:＞70％者59例。对照组血常规检查以上各项指标均在正常值范围以内。由此结果可以看出，CML患者的白细胞均显著增高;有的患者红细胞和血红蛋白正常，有的会出现减少状态;血小板增高，减少和正常的患者都会出现;嗜碱性粒细胞增多明显。这些数据和WHO所提供的参考标准一致。
　　(2)标准血涂片检查的结果白细胞分布呈显著增多，各种阶段粒系细胞都可以看到，其中以中幼粒细胞和晚幼粒细胞增多最为明显，杆状核粒细胞及分叶核粒细胞也呈现增多状态。原始粒细胞所占比例均小于4％，嗜碱性粒细胞占(5％-14％)，嗜酸性粒细胞占（2％-7％），也均呈现明显增多状态。另外，涂片可看到大血小板及畸形血小板者4例，中幼、晚幼红细胞者2例，分叶核细胞中可见核仁者2例。对照组以上检查均正常。
　　(3)骨髓涂片检查的结果骨髓细胞增生明显活跃者36例，极度活跃者59例，红/粒比例接近1:(5-60)，粒系细胞均呈现异常增生，各阶段细胞均明显增多，以中性中幼粒和晚幼粒、杆状核及分叶核粒细胞增生最为明显，原粒细胞大小异常，可看见大原粒5例、小原粒17例，胞质中出现Auer小体5例，发现畸形核细胞，凹陷型2例、扭曲型1例、肾型1例，双核细胞23例;早幼粒细胞外形不规则，并且染色质比正常细胞的粗，染色质颗粒脱出核膜1例，这一类细胞胞浆中的颗粒成分也明显增粗、增多，也有一些细胞脱颗粒现象较为明显，呈现出核、浆发育不一致现象，嗜碱性粒细胞同嗜酸性粒细胞亦增多，原粒细胞＜5％，15例患者样品可见到单核巨噬细胞。
　　(4)髓过氧化物酶染色的结果健康对照组和CML患者的中幼粒、晚幼粒、杆状核及分叶核粒细胞均可见MPO阳性，且各阶段MPO的染色程度不同，呈颗粒状均匀分布，患者组着色较深，即相对酶活性明显高于健康对照组。
　　第二部分应用微流控芯片测定单细胞中髓过氧化物酶
　　(1)芯片有三部分构成盖片、通道层和基底。微通道层采用传统的“十”字形通道设计，宽100μ m，深30μm，通道总长49 mm基本单元包括进样口、鞘液口、检测口、电压控制口、细胞流出口等，本设计的创新点在于在微通道中加入了一组平行电容。该芯片的“十”字形微通道，预染稀释过的血液细胞在A处进行连续振动进样，B、C处连续振动注入鞘液缓冲液，分别调整控微流体溶液的流速，使细胞聚焦，BD段可连接CCD图像检测系统。芯片放置于显微镜的载物台上，随时观察单细胞的流动情况。
　　(2)利用微流控芯片进行分析单个中性粒细胞表达MPO情况分析CML组中性粒细胞表达MPO情况，利用显微镜观察，CCD图像采集技术，发现慢粒组患者中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核粒细胞和分叶核粒细胞均呈现MPO阳性，并且可以看到MPO均呈现颗粒状分布。
　　(3)利用微流控芯片分选中性粒细胞的情况CCD图像采集器记录到的MPO阳性细胞以一定的速度在微通道中向前流动，遇到匀强电场，由于NE细胞自身电性和联苯胺电性的综合影响，它会在匀强电场中做抛物线轨迹的运动。通过实验看到，在距离“十”字中心17mm处，出现了少量的中性粒细胞。
　　(4)比较中性粒细胞表达平均MPO的情况分析每个患者成熟粒细胞和幼稚粒细胞各100个细胞，利用微流控芯片测定每个NE细胞MPO活性程度相对单位。结果发现，CML组患者和健康对照组的幼稚粒细胞，它们的平均MPO活性明显低于各自成熟阶段粒细胞MPO活性，提示MPO表达活性随着粒细胞的成熟而增高;另外发现，CML组成熟和幼稚粒细胞，它们的平均MPO的相对表达活性均明显高于对照组。
　　结论:
　　(1)没有一台血液分析仪能完全代替显微镜进行白细胞分类;镜检应该作为全血细胞分析(CBC)一项很重要的质量控制。
　　(2)应用设计出的微流控芯片能够专一识别出中性粒细胞并且能够对中性粒细胞中的髓过氧化物酶准确识别，根据颜色的深浅可以判断MPO表达的相对活性。
　　(3)本文引入的平均MPO表达活性的概念今后有可能作为慢性粒细胞白血病诊断标志和个体化检查指标。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 应用一般方法检查慢性粒细胞白血病及髓过氧化物酶

1．1 对象和方法

1．1．1 实验材料和仪器

1．1．2 实验方法

1．1．3 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 血细胞分析仪检查的结果

1．2．2 标准血涂片检查的结果

1．2．3 骨髓涂片检查结果

1．2．4 髓过氧化物酶染色的结果

1．3 讨论

1．4 小结

第二部分 应用微流控芯片检查慢性粒细胞白血病患者髓过氧化物酶的表达

2．1 对象和方法

2．1．1 实验材料和仪器

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 微流控细胞芯片装置

2．2．2 利用微流控芯片进行分析单个中性粒细胞表达MPO情况

2．2．3 利用微流控芯片分选中性粒细胞的情况

2．2．4 比较中性粒细胞表达平均MPO的情况

2．2．5 影响因素及条件优化

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 微流控芯片应用在细胞分析中的研究概况

致谢