实验性血管性认知障碍关于胆碱能机制的研究

摘要

背景和目的:目前诸多研究证明中枢胆碱能机制参与了VaD的发病。胆碱乙酰转移酶(CHAT)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)，囊泡乙酰胆碱转运体(VACHT)是胆碱能系统的重要组成部分，维持着乙酰胆碱(ACH)的动态平衡。本文将探索VaD大鼠空间学习记忆能力的变化及其海马CHAT、ACHE、VACHT蛋白表达的变化，并观察不同作用机制的药物盐酸多奈哌齐、丁苯酞(NBP)、红花黄色素(HSYO)、芬戈莫德(FTY720)对VaD大鼠空间学习记忆能力和海马BDNF、VEGF、CHAT、ACHE、VACHT的影响，从而为VaD的药物治疗提供多方向新的靶点和理论依据。
　　方法:本实验采用双侧颈总动脉结扎法(2VO)建立VaD大鼠模型，运用水迷宫方法检测VaD大鼠的空间学习记忆能力，首次同时应用western blot方法、免疫荧光染色检测VAD大鼠海马CHAT、ACHE、VACHT的蛋白表达，来观察胆碱能机制与VaD的关系。并应用丁苯肽、红花黄色素、FTY720对VAD大鼠进行干预，同时应用western blot方法、免疫组化染色或免疫荧光染色的方法，以及RealTime PCR方法，首次检测上述药物对大鼠海马CHAT、ACHE、VACHT、VEGF、BDNF表达的影响，观察上述药物对VaD大鼠胆碱能系统和空间学习记忆能力的影响。
　　结果:1:1.1模型组大鼠每日的逃避潜伏期均比正常组（C组）和假手术组(S组)明显延长（P＜0.05）。模型组大鼠目标象限百分率明显低于正常组和假手术组（P＜0.05）。
　　1.2模型组大鼠海马区CHAT、ACHE、VACHT蛋白表达与正常对照和假手术比较明显下调。
　　1.3 HE染色:正常组和假手术组大鼠海马区细胞边界清楚，胞质呈淡红色，胞核呈蓝色，突起整齐排列于福射层，高倍镜下可见部分核仁。VaD模型组大鼠海马CA1区细胞层数和数量减少，排列紊乱，细胞体积明显缩小，部分细胞呈空泡样变，大量细胞发生死亡，可见核固缩、核破裂，细胞突起结构不清，甚至消失，可见大量炎性细胞浸润。
　　1.4模型组海马区CHAT、ACHE、VACHT免疫荧光染色与模型组比较表达明显减少。
　　2:2.1定位航行实验显示各组大鼠通过5天的训练均建立了空间记忆能力。空间探索实验显示多奈哌齐(A)组目标象限百分率显著高于模型组(O)（P＜0.05)。丁苯酞组(D)的目标象限百分率显著高于模型组(O)组(P=0.018)，且与A组差异无统计学意义(P=0.527)。红花黄色素组(H)的目标象限百分率明显高于O组（P=0.05），H组与A组相比无明显差异（P=0.430）。TY720组(F)目标象限百分率高于O组，但差异无统计学意义（P=0.109），且低于A组，差异也无统计学意义（P=0.149）。
　　2.2 western blot结果显示:除多奈哌齐以外的各治疗组海马CHAT、ACHE、VACHT的表达较模型组均有升高。多奈哌齐组的ACHE表达较治疗组轻度减低，CHAT、VACHT仍比模型组升高。FTY720组(F)、丁苯酞组(D)与模型组(O)组比较，BDNF表达上调。多奈呱齐组(A)、红花黄色素组(H)的BDNF表达与模型组比较均无明显差异。VaD模型组(O) VEGF的表达较假手术组(S)显著上调。多奈呱齐组(A)降低VEGF的表达最为明显。红花黄色素组(H)、FTY720组(F)与S组比较无明显差异，与O组比较表达下调。丁苯酞组(D)比假手术组明显上调，与O组比较无明显差异。
　　2.3 Real Time PCR结果显示:海马区CHAT的mRNA表达:模型组(O)与S组比较mRNA水平明显下调，差异有统计学意义（P＜0.001)，多奈哌齐组(A)、HYSA组(H)、FTY720组(F)及NBP组(D)与O组比较均有升高，差异有统计学意义(其中A、D组与O比较P＜0.001，H、F组P＜0.05)。H、F组较A组减低（P＜0.05），D组与A组比较差异无统计学意义。海马区ACHE的mRNA表达:模型组(O)与S组比较明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001)，A组比O组降低，差异无统计学意义。D组与A组、O组显著升高（P＜0.001），H、F比O组升高，但差异无统计学意义。H组比A组显著升高P＜0.05）。海马区VACHT的mRNA表达:模型组(O)与S组比较明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001），A、H、F、D较O组均升高，其中A、H、D与O的差异有统计学意义（依次为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。而A、H、F、D组间无显著差异。海马区VEGF的mRNA表达:模型组(O)与S组比较明显升高(P＜0.001)，A、H、F组与O比较显著减低，有统计学意义（依次为P＜0.001，P＜0.05，P＜0.01）。D组与O组比无明显差异。H、F、D组与A组比较显著升高，有统计学意义（依次为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001）。海马区BDNF的mRNA表达:模型组(O)与S组比较轻度下调，但无统计学差异。A、H、F、D较O组均升高，但只F、D组有统计学意义（依次为为P＜0.001，P＜0.01），F、D组与A组比较也升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　2.4 HE染色:各干预组大鼠海马CA1区细胞层数和数量基本正常，排列清楚，细胞体积无明显缩小，无明显空泡样变，仅少量细胞可见核固缩、核破裂，细胞突起排列相对整齐。炎性细胞浸润明显减少，特别是FTY720组，多奈哌齐组。
　　2.5免疫组化染色:
　　2.5.1各组大鼠海马CA1和CA3区均可见VECF免疫组化反应阳性细胞，为棕色深染。VaD模型组(O)较正常组和假手术组表达显著增多，丁苯酞组(D)比假手术组明显增多，与模型组比较无明显差异。多奈呱齐组(A)与模型组比较降低VEGF的表达最为明显。红花黄色素组(H)、FTY720组(F)与假手术组比较无明显差异，与模型组比较表达减少。
　　2.5.2 BDNF免疫组织化学阳性细胞主要集中在海马CA1区、CA3区锥体细胞和DG颗粒细胞，为棕色深染。与对照组比和假手术组比较，模型组BDNF免疫反应阳性表达轻微减少。丁苯酞组(D)、FTY720组与模型组比较，BDNF免疫反应阳性表达明显增多。多奈呱齐组(A)、红花黄色素组(H)与模型组比较，无明显差异。
　　2.6免疫荧光染色显示CHAT、ACHE、VACHT均为丁苯酞组(D)、FTY720组、红花黄色素组(H)与模型组比较免疫荧光染色阳性表达增多。多奈呱齐组(A)的ACHE免疫荧光染色阳性表达比模型组略减少，而海马细胞形态、数排列与模型组无明显差异。多奈呱齐组的CHAT、VACHT表达比模型组增多。
　　结论：
　　1.双侧颈总动脉结扎法（2VO法）制作大鼠VaD模型，可以有效模拟人类低灌注导致弥漫性脑缺血缺氧所致病理改变，具有稳定性可重复性。
　　2.VaD大鼠海马CHAT、ACHE、VACHT蛋白表达减少，mRNA表达减少。与其学习和记忆成绩下降相一致，提示CHAT、ACHE、VACHT表达降低可能参与了VaD的发病。
　　3.多奈哌齐可显著提高VaD大鼠的空间学习记忆能力，增加海马CHAT、VACHT的蛋白及mRNA表达，减少ACHE的表达，同时减少VEGF的表达。提示多奈哌齐除了通过抑制胆碱脂酶增加乙酰胆碱含量的直接作用以外，还可能通过抑制了炎症损伤而保护了胆碱能神经元，从而改善了VaD大鼠的空间记忆。为胆碱能抗炎通路理论提供了有效依据。
　　4.丁苯酞可以显著提高VaD大鼠空间学习记忆能力，与多奈哌齐组无明显差异。丁苯酞可以显著提高海马区BDNF、CHAT、ACHE、VACHT蛋白及mRNA的表达。提示丁苯酞可能通过其多重作用机制升高了BDNF的表达，并通过BDNF的神经元保护作用增强了胆碱能系统的功能。
　　5.HSYA可提高VaD大鼠空间学习记忆能力，但作用与多奈哌齐比较弱，且差异无统计学意义。HSYA可提高海马区CHAT、ACHE、VACHT的蛋白及mRNA表达，轻度降低VEGF的表达。HSYA对VEGF的调节作用提示HSYA除通过改善大脑供血供氧的作用机制外，还可能通过减轻炎症损伤而保护了海马胆碱能神经元。
　　6.FTY720可提高VaD大鼠的空间学习记忆能力，但作用比多奈哌齐差，有统计学意义。FTY720可上调VaD大鼠海马区CHAT、ACHE、VACHT、BDNF的蛋白及mRNA表达，轻度下调VEGF。提示FTY720作为免疫调节剂可以减轻缺血性疾病的炎症损伤，并增加BDNF的表达，从而保护了胆碱能神经元，进而改善了VaD大鼠的认知功能。
　　7.本研究从改善大脑供血、保护线粒体、抗炎性损伤等VaD的多方面作用机制出发，选择上述作用机制经多项研究证实已经较明确的三种药物HYSA、NBP、FTY720。结果显示该三种药物对VaD的学习记忆能力、以及胆碱能系统的损伤均有不同程度的改善。提示，对VaD应采取多角度、多靶点的方式进行治疗。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、血管性痴呆大鼠模型建立及其空间记忆和海马CHAT、ACHE、VACHT蛋白表达的变化

1．1 对象和方法

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要仪器

1．1．3 主要试剂及耗材

1．1．4 实验试剂配置方法

1．1．5 实验方法

1．2 结果

1．2．1 水迷宫实验

1．2．2 Western blot检测海马区CHAT、ACHE、VACHT蛋白的表达

1．2．3 海马CA1区HE染色

1．2．4 免疫荧光检测海马CA1区CHAT、ACHE、VACHT的表达

1．3 讨论

1．3．1 VaD大鼠模型与胆碱能系统

1．3．2 VaD的研究发展以及VCI概念的提出

1．3．3 VaD发病机制的研究

1．4 小结

二、丁苯肽、红花黄色素、FTY720对VaD大鼠空间记忆、海马CHAT、ACHE、VACHT、VEGF、BDNF蛋白表达的影响

2．1 对象和方法

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 实验试剂配置方法

2．1．4 实验方法

2．2 结果

2．2．1 水迷宫实验

2．2．2 western blot检测VEGF、BDNF、CHAT、ACHE、VACHT的表达

2．2．3 Real Time PCR检测VEGF、BDNF、CHAT、ACHE、VACHT的mRNA表达

2．2．4 海马CA1区HE染色

2．2．5 免疫组化染色

2．2．6 免疫荧光染色

2．3 讨论

2．3．1 神经营养因子

2．3．2 VaD的治疗

2．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 血管性痴呆胆碱能缺陷的机制及治疗方案

致谢