滤泡辅助T细胞在骨髓增生异常综合征发病机制中作用的研究

摘要

目的:通过研究骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes, MDS）小鼠模型（NUP98-HOXD13转基因小鼠）外周血象及骨髓象变化、脾脏和骨髓滤泡辅助T细胞(Follicular helper T cells, Tfh)数量及其表面诱导性共刺激分子（ICOS）、程序化死亡分子-1(PD-1)、CD40L、OX40的表达情况，以探讨其在MDS发病机制中的作用，进一步阐明机体免疫耐受及免疫监视功能在骨髓增生异常综合征发生、发展过程中的具体机制，为骨髓增生异常综合征的免疫靶向治疗提供理论依据。
　　方法:实验对象 MDS小鼠模型即 NUP98-HOXD13转基因小鼠（NHD13小鼠）(Strain Name：C57BL/6-Tg（Vav-NUP98/HOXD13）；Stock Number：010505）购自美国Jackson实验室，对照选用同源野生型C57BL/6J小鼠。实验组及对照组各5-10只，雄性，6-8周龄。饲养地点为中国医学科学院放射医学研究所动物中心，饲养环境符合SPF级别。
　　第一部分观察 NHD13小鼠外周血象及骨髓象变化。分别选取13只雄性NHD13小鼠及8只与其同源的野生型C57BL/6J小鼠作为实验对象，使用全血细胞自动分析仪对其进行外周血细胞计数，外周血及骨髓细胞涂片经瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态。
　　第二部分观察 NHD13小鼠脾脏淋巴滤泡结构等病理变化，并用免疫组化方法检测5只NHD13小鼠和5只野生型小鼠脾脏细胞表面CXCR5的表达情况。
　　第三部分研究NHD13小鼠脾脏及骨髓来源滤泡辅助T细胞数量及其表面分子ICOS、PD-1、CD40L、OX40的表达情况。分别选取10只雄性NHD13小鼠及其同源的野生型C57BL/6J小鼠作为实验对象，用流式细胞术分别检测脾脏及骨髓来源滤泡辅助T细胞数量及其表面分子ICOS、PD-1、CD40L、OX40的表达情况。
　　第四部分研究NHD13小鼠脾脏来源细胞及骨髓单个核细胞内ICOS、PD-1、CD40L、OX40 mRNA的表达。用实时定量PCR方法分别检测8只NHD13小鼠及其同源的野生型C57BL/6J小鼠骨髓单个核细胞、脾脏来源细胞ICOS、PD-1、CD40L、OX40 mRNA的表达。
　　结果:
　　第一部分 NHD13小鼠外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、血小板数量均明显低于野生型小鼠，且差异具有显著性（P＜0.05）。NHD13小鼠红细胞及血小板体积较野生型小鼠明显增大，差异具有显著性（P＜0.05），NHD13小鼠表现为大细胞性贫血。NHD13小鼠红细胞分布宽度及血小板分布宽度均较野生型小鼠明显增大，二者差异具有显著性(P＜0.05)；与野生型小鼠相比，NHD13小鼠的红细胞及血小板相对大小不均。NHD13小鼠外周血涂片显示白细胞数量、红细胞数量和血小板数量均较野生型小鼠减少。转基因小鼠红细胞体积明显增大。转基因小鼠骨髓中可见双核红细胞、环状核粒细胞和红系造血岛等。
　　第二部分与野生型小鼠相比，NHD13小鼠脾脏内淋巴滤泡及生发中心均明显减少，红髓增宽。免疫组化结果显示NHD13小鼠脾脏细胞表面CXCR5的表达明显低于野生型小鼠，而PD-1的表达明显增高。
　　第三部分 NHD13小鼠脾脏来源 Tfh细胞数量明显少于野生型小鼠（P<0.05），其表面分子 ICOS、CD40L、OX40的表达均明显低于野生型小鼠（P<0.05），PD-1的表达明显高于野生型小鼠（P<0.05）。NHD13小鼠骨髓来源Tfh细胞数量明显少于野生型小鼠（P<0.05），其表面分子 OX40的表达均明显低于野生型小鼠（P<0.05），PD-1的表达明显高于野生型小鼠（P<0.05），ICOS及CD40L的表达在二者之间无明显差异（P＞0.05）。
　　第四部分 NHD13小鼠脾脏细胞内ICOS、CD40L mRNA的表达明显低于野生型小鼠，差异具有显著性(P<0.05)。NHD13小鼠脾脏细胞内PD-1 mRNA的表达明显高于野生型小鼠，差异具有显著性（P<0.05）。NHD13小鼠与野生型小鼠脾脏细胞内OX40 mRNA的表达无明显区别（P>0.05）。NHD13小鼠骨髓单个核细胞内ICOS、CD40L、OX40 mRNA的表达明显低于野生型小鼠，差异具有显著性(P<0.05)。NHD13小鼠骨髓单个核细胞内PD-1 mRNA的表达明显高于野生型小鼠，差异具有显著性（P<0.05）。
　　结论:
　　1、NHD13小鼠外周血三系血细胞均明显低于野生型小鼠，且红细胞、血小板体积偏大，且与野生型小鼠相比，其红细胞及血小板的体积相对大小不均；NHD13小鼠骨髓中可见双核红细胞、环状核粒细胞、粒红系造血岛等异常。
　　2、NHD13小鼠脾脏内淋巴滤泡及生发中心均明显减少，红髓增宽，即免疫相关的功能性结构较少；免疫组化结果显示 NHD13小鼠脾脏细胞表面 CXCR5的表达明显降低，说明脾脏内 CXCR5+T细胞数量减少，而且免疫抑制性分子PD-1的表达升高，由此可推断脾脏免疫功能降低。
　　3、NHD13小鼠脾脏来源Tfh细胞数量减少，其表面免疫共刺激分子ICOS、CD40L、OX40的表达减低，免疫抑制分子PD-1的表达明显升高；NHD13小鼠骨髓来源Tfh细胞数量减少，其表面免疫共刺激分子OX40的表达减低，免疫抑制分子 PD-1的表达升高。与野生型小鼠相比，NHD13小鼠免疫功能低下，免疫耐受功能及免疫监视功能减弱，造成恶性克隆增生。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1研究对象

1.2主要试剂与仪器

1.3研究方法

1.4 统计学方法

2 结果

2.1小鼠外周血常规检测

2.2外周血涂片及骨髓涂片

2.3 NHD13小鼠脾脏病理

2.4 免疫组化检测NHD13小鼠脾脏细胞表面CXCR5、PD-1的表达

2.5 流式细胞术检测小鼠脾脏来源滤泡辅助 T（Tfh）细胞数量及其表面分子ICOS、PD-1、CD40L、OX40的表达

2.6 流式细胞术检测小鼠骨髓来源滤泡辅助 T（Tfh）细胞数量及其表面分子ICOS、PD-1、CD40L、OX40的表达

2.7实时定量PCR技术检测小鼠脾脏细胞内ICOS、PD-1、CD40L、OX40 mRNA的表达

2.8 实时定量PCR技术检测小鼠骨髓单个核细胞内ICOS、PD-1、CD40L OX40 mRNA

3 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 滤泡辅助T细胞的研究进展

致谢