miR-21-5p对颅脑创伤后神经-血管单元修复的影响及作用机制研究

摘要

研究目的：
　　创伤性颅脑损伤（TBI）致残、致死率高，其所致的继发性脑损伤与TBI预后密切相关。神经-血管单元（NVU）是由神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞及细胞外基质等构成的功能单元，通过其中各种成分的相互作用维持脑组织内环境稳态。促进TBI后NVU损伤修复是治疗继发性脑损伤、救治TBI的关键。
　　miRNAs在TBI领域中的研究报道尚少。我所在课题组的前期研究发现，TBI大鼠创伤侧大脑皮层miR-21-5p表达量较伤前明显升高。此外，初步证实miR-21-5p表达水平的升高可以减轻脑组织细胞凋亡，并改善TBI大鼠的神经功能预后。本实验将通过动物实验，进一步阐明miR-21-5p在NVU损伤修复中的作用及机制，为探索TBI后miRNAs治疗的新策略提供理论依据。
　　方法：
　　1.应用qRT-PCR及miRNA原位杂交+免疫荧光双染技术，检测TBI后miR-21-5p在创伤灶脑组织的表达变化，及其在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞及脑微血管内皮细胞中的原位表达变化。
　　2.通过改进的神经功能评分及水迷宫实验，评价 TBI大鼠神经功能；应用TUNEL法细胞凋亡检测，评价miR-21-5p对脑组织细胞凋亡的影响；应用免疫荧光法检测脑微血管密度，评价miR-21-5p对脑组织血管生成修复的影响；通过脑组织干湿重检测、血脑屏障（BBB）Evans Blue渗漏量检测及紧密连接蛋白（Occludin及Claudin-5）定量检测，评价miR-21-5p对BBB通透性的影响。3.应用Western Blot和qRT-PCR技术，检测miR-21-5p可能的作用靶点PTEN、AKT信号通路及其下游蛋白（凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3；血管生成及稳定性相关因子Ang-1、Tie-2）的表达变化，探讨miR-21-5p影响细胞凋亡、血管生成修复及BBB通透性的相关机制。
　　结果：
　　1.（1）TBI后，创伤灶脑组织miR-21-5p表达量自伤后6h起逐渐升高，于伤后3d达峰，随后逐渐下降，于伤后14d降低至假手术组大鼠水平；且miR-21-5p在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、脑微血管内皮细胞（BMVECs）中的原位表达水平均有不同程度的升高。
　　（2）在TBI前后，miR-21-5p在脑神经组织中均主要表达于神经元及星形胶质细胞。
　　（3）通过侧脑室注射脂质体携带的miR-21-5p agomir/antagomir，可以上调/下调创伤灶脑组织于伤后6h、1d及3d的miR-21-5p表达水平，且同时上调/下调 miR-21-5p在以上细胞中的原位表达水平。
　　2.（1）TBI后，脑组织miR-21-5p表达水平的升高可以改善神经功能预后。
　　（2） miR-21-5p的表达可以抑制脑组织细胞凋亡。
　　（3）miR-21-5p的表达可以促进脑组织血管生成修复。
　　（4）miR-21-5p的表达可以减轻BBB渗漏。
　　3.（1）TBI后，脑组织miR-21-5p的表达量可以影响凋亡相关蛋白的表达水平。
　　（2）miR-21-5p可以在转录后水平靶向抑制脑组织 PTEN基因的表达，并促进Akt磷酸化。
　　（3）miR-21-5p的表达可以促进脑组织血管生成及稳定性相关因子Ang-1及Tie-2的表达。
　　结论：
　　1.TBI后，创伤灶脑组织miR-21-5p表达水平升高，且在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、脑微血管内皮细胞中的原位表达水平均有不同程度的升高。
　　2.TBI后，miR-21-5p通过在转录后水平抑制靶基因PTEN的表达，激活Akt通路，从而调控下游凋亡相关蛋白的表达，产生抑制脑组织细胞凋亡的作用。
　　3.TBI后，BMVECs表达的miR-21-5p通过激活Ang-1/Tie-2通路，产生促进脑组织血管生成修复、减轻BBB渗漏的作用。
　　4.TBI后，miR-21-5p可以通过上述作用，保护神经-血管单元，减轻继发性脑损伤，从而改善TBI预后。
　　5.miR-21-5p是TBI后继发性脑损伤的潜在治疗靶点。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、颅脑创伤后脑组织miR-21-5p表达水平的变化及应用脂质体转染技术调控其表达水平的效果研究

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、颅脑创伤后脑组织miR-21-5p表达水平对神经功能预后及神经-血管单元损伤修复的影响作用研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、颅脑创伤后脑组织miR-21-5p表达水平影响神经-血管单元损伤修复的作用机制研究

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: miRNAs治疗策略的研究现状及未来研究展望

致谢