MiRNAs调控BDNF-TrkB通路抑制神经元痫样放电的机制研究

摘要

研究目的：
　　MicroRNA（miRNA）是一类内源性小分子非编码 RNA，作为转录后调控因子，参与癫痫发病机制的多个蛋白编码基因的表达。脑源性神经营养因子（ brain-derived neurotrophic factor， BDNF）-酪氨酸激酶受体 B（tropomyosin-related kinase receptor type B，TrkB）信号通路是癫痫发生的关键通路，选择性中枢神经系统内敲除TrkB基因能完全阻止点燃诱发的癫痫发作。有关研究发现miR-204-5p（miR-204）能通过调控TrkB受体影响肿瘤的发生和转移，深入研究miR-204是否能通过TrkB信号通路调控癫痫的发生，有望为临床癫痫治疗提供新的思路。根据上述研究背景提出本论文的研究目的如下：1.以原代培养的大鼠海马神经元的痫样放电模型为研究对象，通过TrkB受体及其下游信号通路，研究 miR-204抑制神经元痫样放电和电压门控性 Ca2+通道（voltage-gated calcium channel, VGCC）电流的机制。2.在miR-204抑制神经元痫样放电的研究基础上，选取前期研究的在癫痫神经元模型中异常表达并且与BDNF-TrkB通路相关的 miR-132-3p（miR-132）为靶点，研究过表达 miR-132后神经元痫样放电和VGCC电流的改变，为探索其他类型miRs在癫痫发病机制中的作用提供创新思路与方法。
　　研究方法：
　　1.原代培养的海马神经元经无镁细胞外液处理3h，建立神经元痫样放电模型。
　　2. MiR-204调控TrkB信号通路抑制神经元痫样放电的机制研究。
　　(1)通过实时荧光定量 PCR（ real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测神经元痫样放电模型中miR-204的表达改变。
　　(2)应用包含 miR-204-pGLVH1/GFP的慢病毒载体转染原代培养的海马神经元以过表达miR-204，通过qRT-PCR检测过表达miR-204后TrkB mRNA的表达改变。
　　(3) TrkB下游通路的代表性信号分子包括 Akt，PLCγ1，ERK1/2和 CREB。通过western blotting以这些信号分子的磷酸化蛋白水平和总蛋白水平的比值反映信号分子的激活程度，研究神经元痫样放电模型模型中miR-204调控TrkB下游信号分子活性的相关机制。
　　(4)应用全细胞膜片钳电流钳技术检测神经元痫样放电模型的放电特性，神经元痫样放电模型过表达miR-204后检测痫样放电频率的变化。
　　(5)应用全细胞膜片钳电压钳技术检测神经元痫样放电模型 VGCC电流和稳态激活与失活特性的变化，神经元痫样放电模型过表达 miR-204后 VGCC特性的改变。
　　3. MiR-132调控BDNF影响神经元痫样放电的机制研究。
　　为研究其他miRs在癫痫发病机制中的作用是否一致，选取前期研究发现在神经元痫样放电模型中表达上调的 miR-132为靶点，研究miR-132对神经元痫样放电和VGCC电流的调控，并进一步探讨其调控机制。
　　(1)通过qRT-PCR检测神经元痫样放电模型中BDNF mRNA的表达，慢病毒转染过表达 miR-132后观察 BDNF mRNA的表达改变，研究 miR-132调控BDNF表达的机制。
　　(2)应用全细胞膜片钳电流钳技术检测神经元痫样放电模型分别过表达miR-132和孵育外源性BDNF后痫样放电频率的变化。
　　(3)应用全细胞膜片钳电压钳技术检测神经元痫样放电模型分别过表达miR-132和孵育外源性BDNF后VGCC电流特性的改变。
　　研究结果：
　　1. MiR-204调控TrkB信号通路抑制神经元痫样放电。
　　(1)神经元痫样放电模型中miR-204的表达下调：
　　与正常对照组神经元相比，癫痫模型组中miR-204的表达水平明显下降（P<0.001, n=6）。
　　(2) MiR-204负调控TrkB受体mRNA的表达：
　　TrkB mRNA的表达水平在癫痫模型组和对照组无明显差异（P>0.05, n=6）。癫痫模型组过表达miR-204后TrkB mRNA表达明显降低（P<0.001, n=6）。
　　(3) MiR-204抑制TrkB受体下游信号通路的活性：
　　神经元痫样放电模型中Akt信号通路活性无明显改变，PLCγ1（P<0.001, n=6）、ERK1/2（P<0.001, n=6）以及CREB（P<0.001, n=6）信号活性均明显增强。在神经元痫样放电模型中过表达miR-204后PLCγ1信号活性无明显改变（P>0.05, n=6），而ERK1/2信号活性（P<0.01, n=6）以及CREB信号活性（P<0.001, n=6）均明显降低。证明 miR-204主要调控 TrkB受体下游的ERK1/2-CREB信号通路。
　　(4) MiR-204抑制神经元的痫样放电：
　　全细胞电流钳检测正常对照神经元表现为偶发的动作电位发放；而癫痫模型组表现为持续高频的动作电位发放，放电频率比正常对照组明显增高（P<0.001, n=14）。癫痫模型组过表达miR-204后神经元的痫样放电频率明显降低（P<0.001, n=14）。
　　(5) MiR-204抑制神经元痫样放电模型中神经元VGCC电流和活性：
　　神经元痫样放电模型VGCC的最大电流密度增加（P<0.001, n=10），稳态激活曲线的半数激活电压降低（P<0.01, n=10），稳态失活曲线的半数失活电压升高（P<0.01, n=10），表明神经元痫样放电模型VGCC电流增强，通道更易激活难以失活。神经元痫样放电模型过表达miR-204后，最大电流密度降低（P<0.001, n=10），稳态激活曲线的半数激活电压增高（P<0.05, n=10），稳态失活曲线的半数失活电压降低（P<0.01, n=10），说明miR-204抑制神经元痫样放电模型中神经元的VGCC电流和活性。
　　2.神经元痫样放电模型中miR-132抑制BDNF加重痫样放电。
　　(1)在神经元痫样放电模型中miR-132抑制BDNF mRNA的表达：
　　癫痫模型中BDNF mRNA的表达水平明显上调（P<0.001, n=6）。对照神经元过表达miR-132后BDNF mRNA的表达水平明显增高（P<0.001, n=6），而神经元痫样放电模型过表达miR-132后BDNF mRNA的表达水平明显下降（P<0.001, n=6）。
　　(2) BDNF抑制神经元痫样放电，而miR-132逆转这一作用加重神经元痫样放电：
　　癫痫模型组过表达miR-132后放电频率明显增高（P<0.01, n=14）。癫痫模型组孵育BDNF后放电频率明显降低（P<0.001, n=14），但在此基础上过表达miR-132后放电频率又增高到癫痫模型组水平（Mg2+-free+BDNF+miR-132:Mg2+-free=7.11±2.90:6.54±2.64, P>0.5, n=14）。说明BDNF对神经元痫样放电有抑制作用，而在miR-132过表达时这种抑制作用消失，miR-132能明显加重神经元痫样放电。
　　(3) BDNF抑制痫样放电神经元VGCC电流和活性，而miR-132能逆转这一作用加重VGCC电流和活性：
　　癫痫模型组过表达miR-132后VGCC最大电流密度增加（P<0.01, n=10）。癫痫模型组孵育BDNF后VGCC最大电流密度降低（P<0.05, n=10），稳态激活曲线的半数激活电压增高（P<0.001, n=10），稳态失活曲线的半数失活电压降低（P<0.01, n=10），但在此基础上过表达miR-132后逆转了VGCC特性的改变。说明BDNF对痫样放电神经元增强的VGCC有抑制作用，而miR-132则相反加强痫样放电神经元VGCC的电流和活性。
　　结论：
　　1. MiR-204调控TrkB信号通路抑制神经元痫样放电。
　　(1)神经元痫样放电模型中miR-204的表达下调。
　　(2) MiR-204抑制TrkB mRNA的表达。
　　(3)在神经元痫样放电模型中TrkB下游信号通路PLCγ1和ERK1/2-CREB激活，而其中ERK1/2-CREB信号通路的激活能被miR-204抑制。
　　(4) MiR-204抑制神经元痫样放电模型的痫样放电和VGCC电流。
　　2. MiR-132抑制BDNF加重神经元痫样放电。
　　(1)在神经元痫样放电模型中miR-132抑制BDNF mRNA的表达。
　　(2) BDNF抑制神经元痫样放电和 VGCC电流活性，而 miR-132能逆转这一作用加重神经元痫样放电和加强VGCC电流活性。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、MiRNA-204抑制神经元痫样放电的TrkB信号通路机制

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、MiRNA-132调控BDNF加重神经元痫样放电的机制

2.1 对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: BDNF-TrkB及其下游信号通路在癫痫发病机制中的作用

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