阿托伐他汀动员EPCs延缓颅内动脉瘤发展的机制及降低栓塞后复发的潜在价值

摘要

背景和目的：颅内动脉瘤（Cerebral aneurysm,CAs）是危害人类健康的常见、多发病，是造成自发性蛛网膜下腔出血的首要病因，致死率、致残率极高。目前关于颅内动脉瘤(CAs)发生与发展的机制尚不十分明确。以往研究阐明了阿托伐他汀可以通过抑制炎症反应而延缓 CAs的发展。本课题组前期研究显示：CAs患者的EPCs数量降低和功能减退；上调EPCs可降低CAs的发生率并延缓其发展。阿托伐他汀已被证实可以提高 EPCs的数量和功能。因此，我们推测 EPCs及其介导的血管新生是阿托伐他汀延缓 CAs发展的新机制和重要作用靶点。我们通过本研究拟达到以下目的（1）进一步明确 EPCs缺陷在颅内动脉瘤发展过程中的作用，完善颅内动脉瘤形成与发展的病理生理机制。以EPCs为作用靶点，有望丰富颅内动脉瘤预防与治疗的临床新理念。（2）阐明阿托伐他汀调控 EPCs延缓 CAs发展的具体机制，并提出具体的调控方法。以转化医学为指导，在内源性EPC动员治疗颅内动脉瘤方面力争取得突破，探索建立新的临床治疗方式。(3)获得阿托伐他汀治疗颅内动脉瘤新靶点的前期临床研究证据，为CAs的预防与治疗提供新思路。
　　方法：本研究分基础实验和临床试验两部分进行。
　　第一部分：阿托伐他汀通过动员大鼠循环血EPCs延缓CAs进展的机制初探。在此部分中，我们通过结扎左侧颈总动脉和双侧肾动脉后支建立了稳定的Hashimoto大鼠颅内动脉瘤模型。依据研究目的，将所有实验动物分为四组，即正常对照组（n=24)、颅内动脉瘤模型组(CA组，n=24)、小剂量阿托伐他汀干预组(ATR组，3mg/kg/d)和大剂量阿托伐他汀干预组(10mg/kg/d))。采用鼠尾袖套法测定大鼠在未麻醉状态下的血压值。并借助流式细胞仪测定各组大鼠1个月末和3个月末时循环血 EPCs水平。通过剥离大鼠右侧大脑前动脉/嗅动脉（right anterior cerebral artery/olfactory artery，ACA/OA）分叉部血管，行VG染色和电镜学观察，对大鼠Willis环动脉瘤组织进行病理学评估。通过ELISA法、定量RT-PCR法检测大鼠 CAs循环血及血管壁中血管修复/炎症相关因子水平及基因mRNA的表达。通过western blot检测不同剂量阿托伐他汀干预后大鼠CAs壁血管修复/炎症/凋亡相关蛋白的差异表达。最后通过血细胞分析仪及全自动生化分析仪测定各实验组大鼠血常规和生化指标的差异，以评价阿托伐他汀用于治疗颅内动脉瘤的安全性。
　　第二部分：颅内动脉瘤患者介入栓塞治疗后口服阿托伐他汀对循环血 EPCs的影响及降低动脉瘤复发的潜在临床意义。在此部分中，我们从两家神经外科中心共纳入了19未例破裂颅内动脉瘤患者，均需行介入栓塞治疗，并随机分为两组，即口服阿托伐他汀组11例，非口服阿托伐他汀组8例；同时，纳入18名健康志愿者作为对照组。分别于动脉瘤患者入院时、术后第1、4、14、21和30天采集血样。利用流式细胞仪分析技术测定循环血EPCs的数目；利用ELISA法测定血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子α（SDF-1α）水平；利用全自动生化分析仪测定各组患者的血脂及肝肾功能等指标。
　　结果：
　　（1）在第一部分研究中，我们成功构建了稳定的 Hashimoto大鼠颅内动脉瘤模型。通过数据分析，我们发现：与正常组相比，动脉瘤造模术后1个月， CA组和 ATR治疗组大鼠血压值显著升高。动脉瘤造模术后3个月，CA组和ATR治疗组大鼠血压值又恢复到正常水平。第3个月时，ATR治疗组大鼠EPCs水平明显高于CAs组，提示阿托伐他汀可大幅度动员CAs大鼠循环血EPCs。正常组大鼠右侧大脑前动脉/嗅动脉（ACA/OA）血管分叉部未见明显的血管壁退行性改变，而动脉瘤模型组(CAs Group)大鼠在造模术3个月后可见大鼠右侧ACA/OA分叉部血管壁存在明显退行性改变，符合颅内动脉瘤进展的病理学改变。与CAs组相比，ATR组的IEL评分较低，有较厚的中层，形成较小动脉瘤。TEM研究结果显示：正常对照组血管的内皮细胞完整，内弹力无断裂，平滑肌细胞无凋亡，血管外膜解构完整。动脉瘤模型制备3个月后，无药物干预组显示出严重退化的血管壁解构，主要表现为：大部分内皮细胞的消失，内弹力层断裂严重，可见被严重破坏和退化的平滑肌细胞，同时血管的外膜解构也出现紊乱。而经阿托伐他汀干预后，颅底willis环处血管壁可看到部分内皮细胞和部分断裂的内弹力层，部分平滑肌存在，部分外膜组织解构完整，血管壁退行性变明显轻于无药物干预组。ATR组的VEGF、TGF-β水平明显高于CAs组，提示循环中VEGF、TGF-β的高表是阿托伐他汀EPCs动员的趋化因子。阿托伐他汀可使与血管修复相关基因mRNA的表达上调(VEGF、TGF-β)。阿托伐他汀可使与CAs壁炎症相关mRNA的表达下调（NF-kB、MMP-2、MMP-9）。大剂量组阿托伐他汀(10mg/kg/d)能上调促血管因子的表达（VEGF）;下调抑血管生成因子的表达（VEGI）。不同剂量阿托伐汀在抑制CAs壁炎症（MMP-9和MMP-2）方面无差异。大剂量阿托伐他汀使细胞凋亡蛋白Caspase-9的表达增加，对血管壁具有破坏作用。各组大鼠间红细胞、血红蛋白、白细胞、血小板、血脂和肝肾脏功能均无明显差异。
　　(2)在第二部分研究中，我们纳入了19例未破裂颅内动脉瘤患者和18例年龄、性别匹配的健康人群。与健康人群相比，高血压、吸烟和高脂血症在动脉瘤患者中具有较高的比例。各组间用药情况（包括阿司匹林、β-受体阻滞剂和肾素血管紧张素转换酶抑制剂等）、既往脑血管疾病史（冠状动脉疾病，糖尿病和脑血管疾病）和空腹血糖水平等方面无差异。经栓塞治疗后，未口服阿托伐他汀钙片组患者的循环血内皮祖细胞的数量开始慢慢上升，在术后14天达到高峰，而后逐渐下降，至术后第30天时，又下降至接近栓塞前水平。动脉瘤介入栓塞后3周内，其循环血EPCs水平均高于栓塞前/刚入院时水平。口服阿托伐他汀钙片后，在随访30天内，患者循环血EPCs水持续升高，各时间点均明显高于入院时水平，且在第14天时，EPCs的最高峰值是未口服阿托伐他汀组的1.4倍。且在治疗14天后，其循环血EPCs一直保持较高水平。血浆VEGF水平也表现出与循环血EPCs一样的动态变化趋势，即治疗后开始慢慢上升，到14天时达到高峰。口服阿托伐他汀钙片后，在随访30天内，患者血浆VEGF水持续升高，各时间点均明显高于入院时水平，且在第14天时，VEGF的最高峰值是未口服阿托伐他汀组的1.8倍。且在治疗14天后，其血浆VEGF一直保持较高水平。介入栓塞治疗后，既往研究证实， SDF-1α参与EPCs的迁移和归巢，在EPCs介导的血管修复及内皮化方面具有重要的作用。本研究结果显示，在颅内动脉瘤介入栓塞术后，血浆SDF-1α水平逐渐上升，到14天时达到高峰，随后又开始下降，至30天时又恢复至术前水平。口服阿托伐他汀组后，在随访30天内，患者血浆SDF-1α水平一直保持在较高水平，各时间点均明显高于栓塞前/入院时水平。从第14天开始，口服阿托伐他汀组患者血浆SDF-1α水平较No ATR组明显升高。第4天至第14天，口服阿托伐他汀组患者的SDF-1α上升的幅度明显高于非口服啊托伐他汀组（3.3倍 vs1.75倍）。而在治疗14天至21天时，口服阿托伐他汀组血浆SDF-1α扔呈现出上升趋势，至21天时达到最高峰。在手术后第30天时，血浆SDF-1α水平扔保持在较高水平，是非口服阿托伐他汀的3.4倍。本研究通过回归分析显示：在阿托伐他汀治疗组患者中，循环血内皮祖细胞（EPCs）和与血管内皮生长因子（VEGF）呈正相关关系；循环血内皮祖细胞（EPCs）和与基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）呈正相关关系；口服阿托伐他汀患者的血脂水平呈下降趋势，但组间差异无统计学意义。而肝肾脏功能相关指标（ALT、Cr和CK）间无明显差异。
　　结论：
　　（1）本研究通过动物实验阐明了阿托伐他汀可以通过促进血管修复和抑制炎症双重调节作用而延缓颅内动脉瘤的进展。
　　（2）大剂量阿托伐他汀（10mg/kg/d）在促进血管修复方面具有优势，并没有更好地抑制CAs壁炎症，反而增加了血管壁细胞的凋亡，对CAs血管壁具有破坏作用，不是延缓CAs的合理剂量。
　　（3）小剂量阿托伐他汀（3mg/kg/d）用于延缓大鼠 CAs进展是安全有效的，其主要药效是促进血管修复和抑制炎症，而不是降脂作用。
　　（4）基于初步研究数据，我们提出这样一个假说：颅内动脉瘤患者介入栓塞后口服阿托伐他汀可以促使 EPCs从骨髓中动员后释放到循环血；循环血EPCs在趋化因子 SDF-1α的作用下归巢至栓塞部位参与新生内膜的形成。
　　（5）阿托伐他汀对降低颅内动脉瘤介入栓塞后的复发具有巨大的临床应用前景，但尚需进一步的基础实验和前瞻性随机对照试验加以论证。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分：阿托伐他汀通过动员大鼠循环血EPCs延缓CAs进展的机制初探

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第二部分：颅内动脉瘤患者介入栓塞治疗后口服阿托伐他汀对循环血EPCs的影响及降低动脉瘤复发的潜在临床意义

2.1材料与方法

2.2结果

2.3 讨论

2.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述1: 血管重塑和炎症反应在颅内动脉瘤发生与发展中的作用

综述2: 炎症与动脉瘤

致谢

个人简历