腺苷A2受体活化诱导心肌再灌注损伤保护作用的线粒体机制

摘要

目的
　　1.观察腺苷A2受体活化对心肌再灌注时线粒体氧化应激损伤的保护作用。
　　2.探讨腺苷A2受体活化诱导心肌再灌注损伤保护作用的线粒体机制。
　　方法
　　建立离体大鼠心脏缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）损伤模型和心肌H9c2细胞系模拟I/R损伤模型。采用透射电镜和高分辨率呼吸测定仪评定分离线粒体的结构和功能改变。利用线粒体荧光探针JC-1、总活性氧（Reactive oxygen species，ROS）荧光探针DCFH-DA、线粒体超氧化物荧光探针Mitosox Red分别测定分离心肌线粒体和细胞的线粒体膜电位（ Mitochondrial membrane potential，△Ψm）、总ROS和线粒体超氧化物水平。使用Amplex red过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒（Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit）测定H2O2含量及过氧化氢酶（Catalase）活性。用线粒体肿胀实验评定线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的开放程度。用蛋白羰基化检测确定线粒体蛋白的氧化应激损伤程度。Western blotting法检测蛋白表达水平。利用复合体Ⅰ酶活性检测试剂盒（ComplexⅠ enzyme activity dipstick assay kit）检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性。免疫沉淀法富集线粒体复合体I并检测其蛋白酪氨酸磷酸化水平，并用质谱确定酪氨酸磷酸化水平发生变化的目标复合体亚单位，用NetPhosK1.0确定目标复合体亚单位的潜在酪氨酸磷酸化位点。
　　结果
　　1.与sham组相比，I/R组的呼吸控制率（Respiratory control ratio，RCR）下降，肿胀破裂的线粒体增多，△Ψm降低，线粒体对钙离子的抵抗能力减弱，但用非选择性腺苷受体激动剂5’-N-乙基酰胺基腺苷（5’-（N-ethylcarboxamido） adenosine，NECA）处理后这些变化均减轻（均P<0.05）。选择性腺苷A2A受体拮抗剂SCH58261（SCH）和A2B受体拮抗剂MRS1706（MRS）能够不同程度地减弱NECA对线粒体的保护作用（均P<0.05）。这些结果表明，腺苷A2A和A2B受体均参与NECA对I/R诱发的心肌线粒体损伤的保护作用。
　　2. I/R后线粒体蛋白羰基化，线粒体总ROS、H2O2增多，提示再灌注后线粒体ROS增多引起氧化应激损伤（均P<0.05）。给予NECA能够明显抑制线粒体ROS的增多，减轻线粒体的氧化应激损伤，但此作用被SCH或MRS抑制。以上结果表明，腺苷A2A或A2B受体活化能够抑制再灌注早期ROS的增多而减轻线粒体氧化应激损伤。
　　3.细胞实验证实，NECA能够抑制I/R引起的△Ψm减低和ROS增多；线粒体超氧化物歧化酶Peg-SOD具有与NECA类似的作用；二者联合应用对△Ψm的保护作用增强（均P<0.05）。与sham组相比，I/R组超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性降低，但NECA对其活性没有影响；而NECA能够明显增强过氧化氢酶的活性但此作用被SCH或MRS抑制（均P<0.05）。这些结果表明腺苷A2A或A2B受体活化通过增加过氧化氢酶的活性而促进H2O2的分解并减轻线粒体氧化应激损伤。
　　4.与sham组相比，I/R时线粒体呼吸链复合体I活性增强，但被NECA、CGS或BAY所抑制（均P<0.05），表明腺苷A2A或A2B受体活化可能通过抑制再灌注期复合体I的活性而减少ROS的产生。
　　5.与对照组相比，NECA能够增加线粒体Src酪氨酸激酶活性，但此作用被MRS抑制；选择性Src酪氨酸激酶拮抗剂PP2能够减弱NECA对I/R引起的心肌线粒体△Ψm的降低、线粒体对钙离子的抵抗能力减弱以及ROS产生增多等作用（均P<0.05）。另外与NECA组相比，PP2+NECA组复合体Ⅰ的活性降低。以上结果表明，腺苷A2受体活化通过激活线粒体Src酪氨酸激酶而抑制复合体I的活性并抑制再灌注期ROS增多，从而减轻I/R诱导的心肌线粒体损伤。
　　6.质谱和NetPhosK1.0分析推断出复合体Ⅰ NDUFV2亚单位的Tyr-118，191和192位点，NDUFS3的Tyr-146，245位点以及NDUFS2的Tyr-151位点可能起负性调节复合体Ⅰ活性的作用。
　　结论
　　1、腺苷A2A或A2B受体激活后，一方面通过抑制复合体Ⅰ的活性减少再灌注时ROS的产生，另一方面通过增加过氧化氢酶的活性而促进ROS的分解，抑制mPTP的开放，进而减轻再灌注时线粒体的氧化应激损伤。
　　2、NECA通过腺苷A2受体激活线粒体Src酪氨酸激酶，从而抑制复合体Ⅰ活性并抑制ROS的产生，减轻线粒体氧化应激损伤。
　　3、复合体Ⅰ NDUFV2亚单位的Tyr-118，191和192位点，NDUFS3的Tyr-146，245位点以及NDUFS2的Tyr-151位点可能具有负性调节复合体Ⅰ活性的作用。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

目的

方法

研究创新性

一、观察腺苷A2受体活化对心肌再灌注时线粒体氧化应激损伤的保护作用

1.1材料和方法

1.1.1研究对象

1.1.2实验仪器

1.1.3常用试剂BSA

1.1.4关键试剂NECA

1.1.5荧光试剂

1.1.6试剂盒

1.1.7抗体

1.1.8建立大鼠离体心脏灌流和心肌I/R模型实验原理：

1.1.9大鼠心肌组织线粒体的提取

1.1.10 BCA蛋白定量

1.1.11线粒体肿胀实验

1.1.12线粒体呼吸控制率（Respiratory control ratio，RCR）测定

1.1.13 H9c2细胞的复苏、传代和冻存

1.1.14 细胞计数

1.1.15 建立H9c2细胞模拟I/R模型

1.1.16 JC-1染色检测细胞线粒体膜电位变化

1.1.17 DCFH-DA检测总ROS相对含量

1.1.18 Mitosox Red荧光探针检测线粒体内超氧化物水平

1.1.19 Amplex red过氧化氢/过氧化物酶试剂盒测定H2O2水平和过氧化氢酶（Catalase）活性

1.1.20 总SOD活性检测

1.1.21复合体I酶活性检测试剂盒检测线粒体复合体I活性

1.1.22线粒体蛋白羰基化检测

1.1.23考马斯亮蓝染色

1.1.24透射电子显微镜（Transmission election microscopy，TEM）技术

1.1.25 统计学分析

1.2结果

1.2.1腺苷A2受体活化对I/R后线粒体结构和功能的影响

1.2.2腺苷A2受体活化对I/R后线粒体mPTP开放的影响

1.2.3腺苷A2受体活化对I/R引起的氧化应激的影响

1.2.4腺苷A2受体活化抑制氧化应激损伤的机制

1.3讨论

1.4小结

二、探讨腺苷A2受体活化诱导心肌再灌注损伤保护作用的线粒体机制

2.1材料和方法

2.1.1新增仪器和试剂

2.1.2 Western blotting实验原理：

2.1.3 免疫沉淀富集复合体Ⅰ实验原理：

2.1.4 质谱鉴定蛋白种类实验原理：

2.1.5 统计学分析

2.2结果

2.2.1 Src酪氨酸激酶对腺苷A2受体活化抑制线粒体氧化应激损伤的作用

2.2.2 线粒体Src酪氨酸激酶与复合体Ⅰ活性之间的关系

2.3讨论

2.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述:腺苷受体活化与心肌缺血/再灌注损伤

致谢