应用高效毛细管电泳技术检测2型糖尿病肾病尿微量白蛋白的研究

摘要

研究目的:
　　糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是2型糖尿病（Type2 Diabetes Mellitus, T2DM）患者常见的并发症之一。尿微量白蛋白（microalbuminuria, mALB）作为 DN临床诊断的重要指标，在 DN发病早期准确检测 mALB，对DN的治疗和预后具有重要意义。目前临床上检测mALB的常用方法为免疫透射比浊法和放射免疫法。鉴于免疫透射比浊法的 mALB检测灵敏度较差，会造成早期DN的漏检；而放射免疫法存在放射性污染，因此寻求准确、安全检测mALB的方法具有重要临床应用价值。近年来，毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）技术逐渐被应用于血清和尿液中微量元素的检测。本论文研究 CE技术用在检测DN患者尿液中mALB浓度的效果，并提出一种基于吸光度峰高和峰面积去测定尿样中mALB浓度的双因素回归模型，以期提高测量尿液中mALB浓度的准确度，为临床DN的早期诊断提供技术支持。
　　研究方法:
　　1.实验样本分组：4组受试者尿样：正常对照组（Control）32例、单纯糖尿病组（DM）36例、早期糖尿病肾病组（DN-1）19例、临床糖尿病肾病组（DN-2）22例。样本均来自天津医科大学代谢病医院，年龄范围为35~75岁。DM、DN-1、DN-2组以免疫透射比浊法检测结果进行分组。
　　2.尿样处理：将尿样经离心后取上清液，并按1:1000比例向上清液中加入苯甲基磺酰氟（PMSF），置于-80℃低温保存。
　　3. CE测试参数确定：制备mALB标准溶液，采用控制变量法，确定CE检测mALB时所采用的最佳缓冲液的浓度、pH值，毛细管电泳的波长、电压，以及添加剂（十二烷基硫酸钠）的浓度值。
　　4.实验数据获取：在CE最佳实验条件下，测量6种浓度mALB标准溶液的吸光度峰高和峰面积。
　　5.分别建立三类线性回归模型：吸光度峰高与mALB浓度的线性回归模型；吸光度峰面积与 mALB浓度的线性回归模型；吸光度峰高、峰面积与 mALB浓度的二元线性回归模型。
　　6.三类回归模型的检验与评价：对三类回归模型分别进行F检验和复相关系数检验，评价模型的显著性和复相关性，确定优化回归模型。
　　7.应用优化的回归模型测定4组尿样的mALB浓度：在CE最佳实验条件下，基于 mALB吸光度峰高和峰面积，应用优化回归模型分别测定4组尿样的mALB浓度。
　　8.统计学处理：应用方差分析（ANOVA）方法对4组尿样mALB浓度进行统计比较，根据尿样中mALB浓度将受试者重新入组，分析与免疫透射比浊法入组的差异。
　　研究结果:
　　1.基于实验数据确定三类回归模型：
　　①吸光度峰高-mALB浓度的线性回归模型：y=3.34 x1-4.94，F①吸光度峰高-mALB浓度的线性回归模型：y=3.34 x1-4.94，检验：置信度P=0.001；复相关系数检验：R=0.9979；拟合残差为0.0042
　　②吸光度峰面积-mALB浓度的回归模型：y=0.12 x2+17.5 F检验：置信度P=0.001；复相关系数检验：R=0.9983；拟合残差为0.0033③吸光度峰高、峰面积与mALB浓度的二元线性回归模型：y=1.05 x1+0.08 x2+6.76 F检验：置信度P=0.001；复相关系数检验：R=0.9992；拟合残差为0.0017二元线性回归模型的复相关系数R值明显大于一元线性回归模型，选取二元线性回归模型为优化模型测定4组mALB浓度。
　　2.应用优化线性回归模型测定4组mALB浓度：
　　应用优化的吸光度峰高、峰面积与mALB二元线性回归模型，测定各组尿样中mALB浓度：Control组为12.18±0.33mg/L；DM组为14.23±0.40mg/L；DN-1组为107.07±8.30mg/L；DN-2组为494.60±50.01mg/L，可见，DM组与Control组无统计学差异；DN-1组显著高于Control组和DM组；DN-2组显著高于其他三组。
　　3.应用优化的二元线性回归模型测定4组尿样中mALB浓度，根据mALB浓度分组，结果显示：DM组中有两例患者尿样中mALB浓度高于DN-1入组标准20mg/L，这两例患者按mALB标准为早期DN（DN1）；一例DN-1患者尿样中mALB浓度高于DN-2入组标准200mg/L，该患者按mALB标准为临床DN期（DN-2），以上结果提示应用CE方法检测尿样mALB浓度可能检测出免疫透射比浊法漏检的DN-1和DN-2组。
　　研究结论:
　　1.应用吸光度峰高、峰面积两个因素建立的测定 mALB浓度的二元线性回归模型，复相关系数R值优于一元线性回归模型，提示该二元线性回归模型是测定mALB浓度的优化模型。
　　2.应用优化二元线性回归模型测定DM组和DN-1组尿液mALB浓度差异显著性高，应用优化二元线性回归模型测定mALB浓度能更准确区别DM组和DN-1组，提示优化模型后测定mALB浓度在检测DN早期灵敏度更高。
　　3.应用CE检测4组尿样，其结果优于免疫透射比浊法对DN-1和DN-2组的检出率：40例免疫透射比浊法为阴性的DM组中2例为早期DN（DN-1）；用免疫比浊法检测的27例早期DN（DN-1）中，1例由CE技术检测为临床DN期（DN-2），提示CE方法检测mALB浓度优于免疫透射比浊法。

目录

声明

缩略语/符号说明

一、前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

1.4 论文的结构

二、原理和方法

2.1 毛细管电泳检测mALB的原理

2.2 实验仪器与材料

2.3 受试者入组条件及尿液样品分组

2.4 样品准备及预处理

2.5 标准溶液制备

2.6 实验数据获取

2.7 线性回归模型的建立和检验

2.8 尿样中mALB浓度的确定

2.9 统计学处理方法

三、结果

3.1 各组受试者临床特征

3.2 CE对mALB标准样的分离

3.3 mALB浓度的线性回归模型

3.4 尿样样品分析结果

3.5 尿样的mALB浓度

四、结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.3 小结

五、总结与展望

5.1 主要研究工作的总结

5.2 本论文的创新点

5.3 研究工作的展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:毛细管电泳与质谱联用技术在蛋白质分析上的应用

致谢

个人简历