miR-106b~25 cluster下调EP300诱导乳腺癌细胞产生非ABC转运蛋白家族依赖性多药耐药性

摘要

背景：
　　化疗作为乳腺癌综合治疗中的举足轻重的部分，对延长患者的无病生存期及复发转移后的长期生存均起到关键作用。但肿瘤细胞所表现出的多药耐药性（Multidrug Resistance，MDR）却影响着肿瘤综合治疗的效果。因此化疗耐药性成为当今肿瘤治疗领域亟待解决的关键问题之一。肿瘤细胞通过何种途径产生化疗耐药性，基因、蛋白及信号通路等是如何参与耐药性的形成等问题，至今仍在研究当中。microRNAs（miRNAs）是一类内源性的、进化上高度保守的、长约18-25个碱基序列的非编码RNA，广泛存在于真核细胞中。近年来通过研究发现microRNA通过碱基互补配对与靶mRNA序列的3’UTR相结合，从而对基因的表达起到调控作用，进而影响细胞增殖与凋亡、细胞周期等[1-3]。目前的研究显示，microRNA参与了肿瘤发生发展的各个过程，包括肿瘤对化疗药物的耐药过程。这为我们进一步探究肿瘤多药耐药新提供了新的思路和研究方向。在本文的研究中，我们主要针对影响乳腺癌细胞多药耐药性的microRNA—miR-106b~25 cluster，探究其在乳腺癌MDR形成过程中所发挥的功能，并探索miR-106b~25与相关分子之间相互作用的机制。
　　方法：
　　在MTMEC细胞中用慢病毒感染方式过表达miR-106b~25 cluster形成MTMEC-miR-106b~25细胞系，采用耐药克隆形成的实验方法，评价MTMEC-miR-106b~25细胞对阿霉素、紫杉醇、VP-16及秋水仙素的敏感性，同时验证紫杉醇对诱导该细胞系产生细胞凋亡能力的影响；应用慢病毒感染的方式在MTMEC细胞中稳定干扰EP300的基因表达，采用耐药克隆形成实验、化疗药物的细胞毒性实验（MTT），评价其对紫杉醇的敏感性；应用RT-qPCR技术测定MTMEC-ev、MTMEC-miR-106b~25、MTMEC-shEP300及NCI-ADR/RES、CAL51中ABCB1的mRNA的表达水平；应用流式细胞技术评价MTMEC-ev、MTMEC-miR-106b~25、MTMEC-shEP300及NCI-ADR/RES、CAL51细胞中P-糖蛋白的表达水平及各种细胞内药物蓄积水平；应用流式细胞仪分析紫杉醇作用下的MTMEC-ev、MTMEC-miR-106b~25、MTMEC-shEP300细胞其细胞周期的改变；采用Annexin V/PI染色法、caspase-3/7活性检测以及caspase-9检测法3种方法检测紫杉醇对细胞凋亡的诱导作用；应用干扰RNA使MTMEC细胞中E-cadherin的表达水平下调，并针对MTMEC-shCDH1细胞应用化疗药物的细胞毒性实验（MTT）、耐药克隆形成、Annexin V/PI染色法、caspase-3/7活性检测以及 caspase-9检测法、P-糖蛋白表达水平检测、细胞内药物蓄积实验，判断MTMEC-shCDH1细胞与过表达miR-106b~25 cluster或抑制EP300表达的MTMEC细胞是否具有相似生物学功能。
　　结果：
　　1.在MTMEC细胞系中过表达miR-106b~25 cluster，能够削弱乳腺癌细胞对于化疗药物的敏感性，从而产生针对包括阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、秋水仙素在内的多种常用化疗药物的交叉耐药性：在耐药克隆形成实验中稳转后所得的细胞系耐药克隆形成能力显著增强。干扰并下调EP300的表达水平同样能增强该细胞系紫杉醇耐药性：耐药克隆形成实验结果与过表达miR-106b~25 cluster时所得结果趋势相同；在MTT中发现，MTMEC-miR-106b~25及MTMEC-shEP300细胞的IC50值较MTMEC细胞均明显升高。
　　2.过表达miR-106b~25 cluster或干扰EP300表达使其下调，均能减弱紫杉醇诱导细胞凋亡的能力。同时，利用流式细胞仪检测发现：MTMEC-miR-106b~25细胞与MTMEC-shEP300细胞较MTMEC-ev细胞相比，在相同浓度紫杉醇作用条件下，前两者G2/M期细胞比例明显降低，而G1期细胞比例则相应升高。此外，前两者凋亡细胞比例明显降低，且细胞凋亡相关蛋白caspase-3/-7及caspase-9活性明显降低。
　　3.过表达miR-106b~25簇或下调EP300表达水平所诱导的肿瘤细胞多药耐药性，是独立于P-gp表达而形成的。通过RT-QPCR技术及流式细胞术显示：MTMEC-ev细胞、MTMEC-miR-106b~25细胞与MTMEC-shEP300细胞三者在P-gp蛋白表达量及相应基因的表达水平上并无明显差异，且在测定细胞内药物蓄积水平的实验中发现，无论环孢菌素存在与否，药物在三种细胞中的蓄积水平基本相同，且与阴性对照组细胞内蓄积水平趋势相同。
　　4.E-cadherin表达水平的下调同样能诱导细胞产生多药耐药性、削弱紫杉醇诱导细胞凋亡的能力，且该种药物耐药性的产生不依赖P-gp的表达而独立存在。针对MTMEC-shCDH1细胞，在相同实验条件下，重复上述实验，得到的结果与前述实验结果趋势相同。
　　结论：
　　EP300作为miR-106b-25cluster的下游靶基因，在敏感细胞系MTMEC中过表达miR-106b~25 cluster或下调EP300表达水平，均能增强细胞对多种化疗药物的耐药性，同时能减弱紫杉醇作用下产生的细胞凋亡作用，表现为MTMEC-miR-106b~25细胞与MTMEC-shEP300细胞中凋亡细胞比例显著减少，且细胞内凋亡相关蛋白caspase-3/-7及caspase-9表达水平明显下降；同时减少了G2/M期细胞比例，使G1期细胞显著增加。在MTMEC细胞中下调E-cadherin的表达水平同样能得到相同趋势的实验结果。且在上述诱导形成的多种耐药细胞中P-gp表达水平均未见明显变化。即通过过表达miR-106b~25 cluster或下调EP300/E-cadherin表达水平所诱导形成的多药耐药性是通过凋亡逃逸机制形成的，与细胞表面P-gp表达并无相关性。这或许会为耐药性乳腺癌的治疗提供新的思路和治疗靶点。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

实验对象和方法

1.1实验对象

1.2常用试剂

1.3主要仪器

1.4主要溶液配方

1.5实验方法

结果

2.1 miR-106b~25 cluster慢病毒浸染及稳转细胞系的建立

2.2过表达miR-106b~25 cluster使乳腺癌细胞系产生多药耐药性

2.3 下调EP300表达水平促使乳腺癌细胞形成紫杉醇耐药性

2.4 ABC转运体与过表达miR-106b~25或下调EP300引起MDR无关

2.5 紫杉醇能够诱导MTMEC细胞系的细胞凋亡

2.6 过表达miR-106b~25或下调EP300抑制紫杉醇诱导的细胞凋亡

2.7 过表达miR-106b~25或下调EP300抑制紫杉醇对细胞周期的阻滞作用

2.8 下调E-cadherin水平导致非转运蛋白依赖性多药耐药性的形成

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: miR-106b~25簇调控肿瘤的发生发展的研究进展

致谢

个人简历