bFGF诱导骨髓间充质干细胞迁移和分化为肿瘤相关成纤维细胞促进乳腺癌生长研究

摘要

目的：
　　骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的骨髓基质干细胞，除了维持造血，越来越多的研究发现其主动参与了肿瘤的发生和发展。研究发现BMSCs具有很好的肿瘤趋向性，而外源性bFGF可以通过活化AKT信号通路体外促进骨髓间充质干细胞的迁移。此外，肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs；tumor-associated fibroblasts,TAFs）作为肿瘤微环境中主要的间质细胞，可以分泌胶原及肿瘤生长转移所必需的一些生长因子参与肿瘤进展。目前，关于CAFs的起源主要有以下几种说法：原位静止的成纤维细胞、上皮间质转化、内皮间质转化以及骨髓起源的间质干细胞。越来越多的研究关注在BMSCs向CAFs的转分化研究，然而具体的诱导分子及其转分化的机制目前仍不清楚。有研究表明bFGF可以活化正常的成纤维细胞，使其转变成α-SMA高表达的激活的成纤维细胞。因此，本研究旨在探索乳腺癌肿瘤条件培养基中的bFGF对BMSCs迁移的作用、BMSCs对乳腺癌体外增殖与体内生长的作用以及bFGF对BMSCs向CAFs的转分化诱导作用及相关的信号传导机制。
　　方法：
　　无菌分离BALB/C小鼠BMSCs，形态鉴定后进行体外培养，流式细胞仪鉴定细胞表型。购买的小鼠BMSCs进行流式表型及分化功能鉴定。制备4T1乳腺癌细胞条件培养基（Tumor-conditioned medium,TCM）和BMSCs条件培养基（Bone mesenchyml stem cell-conditioned medium,BMSC-CM）。Wound-healing及Transwell实验检测4T1乳腺癌细胞、TCM、特异性bFGF中和抗体及外源性bFGF对BMSCs迁移能力的影响。台盼蓝实验及MTS比色法检测在正常血清条件（10%FBS）及低血清条件（1%FBS）下 BMSC-CM对4T1细胞体外增殖的影响。4T1乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型验证BMSCs对乳腺癌的体内生长作用。免疫组织化学染色方法检测各组移植瘤模型增殖细胞核抗原（PCNA）、CD34、α-平滑肌蛋白的的表达。
　　免疫荧光、Western blot实验检测50%TCM、10ng/ml bFGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）处理48小时后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的表达情况。苦味酸-天狼猩红染色检测50%TCM、10ng/ml bFGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）处理48小时后，BMSCs细胞胶原纤维的表达情况。RT-PCR检测50%TCM、10ng/ml bFGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）处理48小时后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、胶原I及胶原III mRNA的表达情况。Western blot检测10ng/ml bFGF及ERK特异性抑制剂（PD98059）处理48小时后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、ERK、p-ERK、Smad3、p-Smad3的蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.全骨髓培养法成功分离出小鼠 BMSCs，培养的第3代细胞呈明显纤维细胞样，排列有一定的方向性，折光性强。随着传代次数的增加，细胞纯度不断增加。培养的第8代细胞具有较强的增殖活力，细胞纯度较高，细胞表型为CD29+（82.1%）CD44+（93.8%）。其中，CD29+CD44+占82.3%。
　　2.购买的BALB/C小鼠 BMSCs具有典型的 BMSCs形态，细胞表型为Sca-1+CD29+CD44+CD105+CD11b-CD34-CD45-CD117-。BMSCs在成脂培养基和成骨培养基的诱导下可分化为脂肪细胞和骨细胞。
　　3.Wound-healing实验结果显示：20% TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组未见明显差异，无统计学意义(P＞0.05)，而50%TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组明显增加(P<0.001)。
　　4.Transwell小室实验结果显示：4T1肿瘤细胞组、50%TCM组、TCM组以及阴性对照组BMSCs迁移的细胞数分别为38±3、50±2、53±8、22±6，4T1组迁移的BMSCs细胞数较空白对照组增加(P<0.05)，50%TCM组、TCM组迁移的BMSCs细胞数较对照组明显增加(P<0.01)。
　　5. Wound-healing实验结果显示：50% TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组增加(P＜0.05)，而50%TCM+FGF-Ab组BMSCs迁移的距离较50%TCM组缩短(P<0.05)。
　　6.Transwell小室实验结果显示：50%TCM组、TCM组、50%TCM+FGF-Ab组、TCM+FGF-Ab组以及阴性对照组迁移的BMSCs细胞数分别为90±13、111±5、57±6、72±18、61±20，50%TCM及TCM组迁移的细胞数较空白对照组增加(P<0.05)，而50%TCM+FGF-Ab组迁移的细胞数较50%TCM组减少(P<0.05)。TCM+FGF-Ab组迁移的细胞数较TCM组也减少(P<0.05)。
　　7.Wound-healing实验结果显示：10ng/ml bFGF组、50ng/ml bFGF组BMSCs迁移的距离较空白对照组增加(P＜0.01)，而且50ng/ml bFGF组细胞迁移的距离较10ng/ml bFGF组增加，呈剂量依赖性(P<0.01)。
　　8.Transwell小室实验结果显示：10ng/ml bFGF组、50ng/ml bFGF组以及阴性对照组迁移的BMSCs细胞数分别为55±6、78±8、32±5。10ng/ml bFGF组、50ng/ml bFGF组迁移的细胞数较空白对照组明显增加(P＜0.05，P＜0.001)，而且50ng/ml bFGF组迁移的细胞数较10ng/ml bFGF组增加(P<0.001)。
　　9.50%TCM、50%TCM+FGF Ab、TCM、TCM+FGF Ab、10ng/ml bFGF、50ng/ml bFGF作用于BMSCs12h后，与对照组相比，各组对BMSCs的增殖均无影响(P＜0.05)。
　　10.Western Blot实验结果显示小鼠BMSCs表达FGFR1，且bFGF作用后不影响BMSCs FGFR1的表达。
　　11.台盼蓝计数实验结果显示：正常血清（10%FBS）培养条件下，对照组、20%BMSC-CM组、50%BMSC-CM组的4T1细胞数分别为4.43±0.5（×104）、6.20±0.46（×104）、10.58±0.94（×104）。低血清（1%FBS）培养条件下对照组、20% BMSC-CM组、50% BMSC-CM组的4T1细胞数分别为1.83±0.38（×103）、5.75±0.25（×103）、10.83±2.92（×103）。实验结果显示在正常血清及低血清培养条件下，BMSC-CM均能促进4T1乳腺癌细胞的增殖（P＜0.05）。随着BMSC-CM浓度的增加，4T1乳腺癌细胞的细胞数逐渐增加，呈浓度依赖性（P＜0.01）。
　　12. MTS比色法结果显示：20%及50%BMSC-CM组的4T1乳腺癌细胞吸光度值（A值）分别为1.467±0.162及1.645±0.084，两组吸光度显著高于对照组（0.900±0.008）(P＜0.05)。
　　13.4T1乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型结果显示：4T1细胞单注射组、BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的瘤块体积分别为688.86±105.85、973.90±95.68、1223.17±167.39（mm3），瘤重分别为475.59±73.50、697.73±39.93、834.77±119.82（mg）。与4T1细胞单注射组相比，BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大(P＜0.05)。与4T1细胞单注射组相比，TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大(P＜0.05)。与BMSCs和4T1细胞共注射组相比，TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大，但没有统计学意义(P＞0.05)。
　　14.免疫组织化学染色发现BMSCs和4T1细胞共注射组及TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组肿瘤细胞PCNA的表达明显高于4T1肿瘤细胞单注射组（P＜0.001)。
　　15.4T1乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤表面坏死率结果显示：4T1细胞单注射组、BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤表面坏死率分别为26.86±8.23（%）、5.96±3.46（%）、5.05±3.10（%）。与4T1细胞单注射组相比，BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤表面坏死率更小(P＜0.001)。
　　16.免疫组织化学染色结果显示：与4T1细胞单注射组相比，BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组CD34阳性的微血管数目增加（P＜0.01）。
　　17.免疫组织化学染色结果显示：与4T1细胞单注射组相比，BMSCs和4T1细胞共注射组及TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组肿瘤组织间质中α-平滑肌蛋白的表达明显增加（P＜0.001)。
　　18.免疫荧光实验结果显示：与对照组相比，50%TCM、10ng/ml bFGF处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达明显增加。向50%TCM组加入特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）后，50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的作用被抑制。10ng/ml TGF-β处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达轻度增加。
　　19. Western blot实验结果显示：与对照组相比，50%TCM、10ng/ml bFGF、10ng/ml TGF-β处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达增加。加入特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）后，50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的作用被抑制。
　　20.苦味酸-天狼猩红染色结果显示：与对照组相比，50%TCM、10ng/ml bFGF、10ng/ml TGF-β处理后，BMSCs细胞胶原纤维的表达增加。加入特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）后，50%TCM促 BMSCs细胞表达胶原纤维的作用被抑制。
　　21.RT-PCR结果显示：与对照组相比，50%TCM、10ng/ml bFGF处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、胶原I及胶原III mRNA的表达水平明显增加（P＜0.001）。加入特异性bFGF中和抗体（20ng/ml）后，50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白、vimentin及胶原III mRNA的作用被抑制，而对胶原I mRNA的表达无明显作用。而10ng/ml TGF-β处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和胶原I mRNA的表达增加（P＜0.05），而其抑制vimentin及胶原III mRNA的表达（P＜0.05）。
　　22.Western blot实验结果显示：10ng/ml bFGF处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3的蛋白明显增加，而Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。ERK特异性抑制剂（PD98059）处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3蛋白的表达明显降低，而 Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。10ng/ml bFGF和PD98059共处理后，BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3蛋白的表达明显降低，而Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。
　　结论：
　　1.采用全骨髓培养法可以成功分离出小鼠 BMSCs，经流式细胞仪鉴定细胞表型为CD29+CD44+，纯度在80%以上。但是，冻存后复苏，细胞活力较差。
　　2.购买的小鼠BMSCs流式细胞表型Sca-1+CD29+CD44+CD105+CD11b-CD34-CD45-CD117-，且具有多向分化的潜能。
　　3.乳腺癌肿瘤微环境中的bFGF可以促进BMSCs的迁移，提示bFGF参与了乳腺癌细胞对BMSCs的招募。
　　4.BMSCs促进乳腺癌细胞体外增殖及乳腺癌移植瘤模型体内生长。
　　5.BMSCs促进乳腺癌移植瘤模型血管生成。
　　6.BMSCs促进4T1乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型中肿瘤间质α-SMA的表达。
　　7.乳腺癌肿瘤微环境中的bFGF诱导BMSCs分化为CAFs。
　　8.ERK/Smad3信号通路参与了bFGF诱导的BMSCs向CAFs的转分化。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、乳腺癌微环境中的bFGF促进BMSCs迁移

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、BMSCs促进4T1乳腺癌细胞体外增殖与体内生长

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、bFGF诱导BMSCs分化为肿瘤相关成纤维细胞

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:骨髓间充质干细胞与肿瘤间质相关成纤维细胞及肿瘤细胞的关系研究进展

致谢

个人简历