特立帕肽通过调控细胞内活性氧治疗激素性骨质疏松

摘要

目的：从细胞以及动物水平研究特立帕肽对激素性骨质疏松的作用及其相关机制；从细胞水平探究特立帕肽对骨细胞氧化应激的缓解作用以及对地塞米松的拮抗作用；从动物水平构建激素性骨质疏松的大鼠模型，验证特立帕肽的抗骨质疏松作用，并进一步验证AKT通路在其中的作用机制。 方法：第一部分 从细胞水平探讨特立帕肽的抗氧化应激作用，分别用地塞米松和特立帕肽处理MLO-Y4细胞系，使用DCFH-DA试剂盒对细胞内的活性氧含量进行检测，使用激光共聚焦显微镜观察荧光强度；同时使用RT-PCR验证有关氧化应激相关基因SOD2mRNA和CAT mRNA的表达量；使用western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3的活性，以便进一步研究特立帕肽是否对骨细胞有抗凋亡作用。第二部分 建立激素性骨质疏松的模型，并用特立帕肽进行干预，观察其治疗激素性骨质疏松的效果；从直观的角度扫描显微CT，测量骨量相关指标；同时使用western blot探索AKT信号通路在其中的作用机制。 结果：1.细胞增殖能力的测定：在第0天时各组细胞的增殖能力相同，在第一天时，地塞米松处理组的细胞增殖能力明显低于对照组和特立帕肽处理组，在第二天对照组细胞增殖能力高于特立帕肽处理组高于地塞米松处理组，第三天对照组细胞增殖能力高于特立帕肽处理组高于地塞米松处理组，提示特立帕肽能够显著缓解地塞米松对细胞增殖的抑制作用。对细胞核进行DAPI染色，以进一步确定并检测细胞的增殖能力，使用激光共聚焦显微镜观察细胞的大体形态并了解细胞的增殖能力，研究发现：对照组细胞的细胞量随着时间的增加而增加，而地塞米松处理组细胞增殖能力明显受到抑制，在第二天细胞量明显降低，第三天细胞量增加亦不明显，而特立帕肽处理组，该处理组细胞量比地塞米松处理组明显增加，但是增殖速度仍然不如对照组细胞，这说明特立帕肽虽然能够促进细胞的增殖，但是不能彻底逆转地塞米松诱导细胞凋亡的不利作用。2.细胞内活性氧的测定：实验使用DCFH-DA试剂盒测定细胞内的活性氧水平，并对特立帕肽去除细胞内活性氧的水平进行了测定。首先使用地塞米松干预细胞，结果发现在地塞米松处理组，细胞内的活性氧水平明显增高。而对照组细胞内的活性氧水平并不高，但是在给予特立帕肽干预后，细胞内的活性氧水平能明显降低，同时使用NAC（一种抗氧化酶）干预地塞米松处理过的细胞，细胞内的活性氧水平也明显降低，这说明特立帕肽同NAC作用相同。RT-PCR的方法检测了细胞内SOD2mRNA的表达，结果发现对照组SOD2的表达量要明显高于其他处理组，而地塞米松处理组SOD2的表达量最低，地塞米松+NAC处理组与地塞米松+特立帕肽处理组的SOD2的表达水平相近，地塞米松处理组的SOD2表达水平与其他处理组有显著的统计学差异，这说明地塞米松能明显抑制SOD2的表达。3.细胞凋亡的测定：特立帕肽能够显著的降低细胞内Cleaved caspase-3蛋白和BAD蛋白的水平并升高bcl-2蛋白的水平，这说明特立帕肽能够抑制细胞的凋亡，而地塞米松促进细胞的凋亡，特立帕肽能够逆转地塞米松促进细胞凋亡的不利作用。结合上述实验结果可以推论：特立帕肽是通过降低细胞内活性氧的水平来抑制细胞凋亡的；进一步的研究结果发现：特立帕肽确实能够通过抑制细胞内Cleaved caspase-3和BAD的表达，从而降低细胞凋亡的水平。4.实验提取大鼠的原代骨髓间充质干细胞，进行细胞培养，为了观察AKT蛋白在细胞内的表达，实验中分别对细胞进行地塞米松和地塞米松+特立帕肽的处理，处理6个小时后，对细胞进行AKT抗体的染色，结果发现地塞米松可以显著降低AKT蛋白的表达；但是在地塞米松+特立帕肽处理组，研究发现特立帕肽可以逆转地塞米松抑制细胞增殖的作用，特立帕肽能够促进AKT蛋白的表达，而AKT蛋白是可以促进细胞的增殖。因此，实验结果从动物模型以及细胞水平进一步证实了特立帕肽促进骨细胞的增殖作用。5.研究通过观察特立帕肽处理组的骨质疏松模型大鼠，发现其骨量较地塞米松处理组的大鼠明显升高，但是仍然略低于对照组，这说明特立帕肽可以很好的抑制激素性骨质疏松的进展，从而逆转激素引起的骨质疏松。BV/TV在特立帕肽处理组明显高于地塞米松处理组，但是仍然略低于对照组，各组之间有统计学差异。TB.TH在特立帕肽处理组明显高于地塞米松处理组，但是仍然略低于对照组，各组之间有统计学差异。TB.n在特立帕肽处理组明显高于地塞米松处理组，但是仍然略低于对照组，各组之间有统计学差异。TB.sp在特立帕肽组明显高于地塞米松处理组，但是仍然略低于对照组，各组之间有统计学差异。另外实验检测了特立帕肽的成骨能力，选取Runx2和BMP2作为反映成骨的指标，研究结果发现：特立帕肽处理组的Runx2和BMP2表达量要明显高于地塞米松处理组，因此认为特立帕肽通过提高成骨基因的表达来促进激素性骨质疏松的成骨作用，进而对其产生很好的干预效果。 结论：本实验研究从地塞米松可以引起细胞内活性氧增高的角度，用体外实验的方法来探索激素性骨质疏松的发病机制，同时实验中使用特立帕肽干预地塞米松处理过的骨细胞，发现特立帕肽可以有效的降低细胞内活性氧的产生，促进细胞的增殖，从而降低地塞米松对细胞增殖的抑制作用，进而逆转激素性骨质疏松，本实验从新的角度阐释了特立帕肽的作用机制；特立帕肽可以有效的降低细胞内的活性氧水平，从而抑制骨细胞的凋亡，并且在动物试验中得到证实；本次实验发现：特立帕肽可以促进AKT信号通路激活，从而促进骨细胞的增殖，起到成骨作用；另外本次实验对于特立帕肽和成骨相关基因BMP2和Runx2表达的关系进行了探索，结果发现：特立帕肽能显著的促进这些基因的表达从而促进成骨；实验中对实验动物进行的microCT扫描结果也提示：特立帕肽能够提高实验动物的骨骼骨量。总之，地塞米松可以增加细胞内的活性氧水平而从促使骨细胞凋亡引起激素性骨质疏松症，而特立帕肽可以降低细胞内的活性氧水平以及其它多种途径抑制骨细胞的凋亡，增加骨量，改善激素性骨质疏松。

目录

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【结果】1. 细胞增殖能力的测定：在第0天时各组细胞的增殖能力相同，在第一天时，地塞米松处理组的细胞

一、特立帕肽对骨细胞氧化应激与凋亡的影响

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1.2结果

使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的情况，实验初始每孔放入5000个细胞，在第0天时各组细胞的增殖能力

为了进一步确定并检测细胞增殖的能力，实验对细胞核进行DAPI染色，使用激光共聚焦显微镜观察其细胞的大

图1.1：A，CCK-8测定细胞的增殖能力，可以发现特立帕肽能够促进细胞的增殖，降低地塞米松的副作用

1.2.2 细胞内活性氧的测定结果

使用DCFH-DA试剂盒测定细胞内的活性氧水平，并对特立帕肽去除细胞内活性氧的水平进行测定，首先使用

实验中首先测量了用Dex或Dex + Teriparatide处理的骨细胞中的细胞内ROS水平。免疫

同时实验中用RT-PCR的方法检测了细胞内SOD2 mRNA的表达，结果发现在对照组SOD2的表达量

实验中使用RT-PCR的方法检测了细胞内CAT mRNA的表达，我们发现在对照组CAT的表达量要明显

另外实验检测了地塞米松处理组、对照组、地塞米松+特立帕肽处理组、地塞米松+NAC处理组的细胞增殖水平

1.2.3 特立帕肽能够通过降低细胞内活性氧的水平抑制细胞的凋亡

图1.3，细胞内Cleaved caspase-3、bad、bcl-2的表达水平，特立帕肽能够抑制细

1.3讨论

特立帕肽是指构成完整甲状旁腺激素（PTH，84个氨基酸）的前34个氨基酸的分子

临床上，最初的特立帕肽3期研究计划为期三年，但在中位时间为19个月后必须停止，因为在F344大鼠研究

骨折预防试验包括骨质疏松症的绝经后妇女定义为至少两个中度无创性椎体骨折，一个中度椎骨骨折和BMD T

以上的临床结果表明，特立帕肽能够显著降低骨折的风险，但是特立帕肽降低骨折风险的原因并不是十分的清楚，

而本次实验结果也进一步证实了，地塞米松能够引起细胞内活性氧的增加，而特立帕肽也确实能够清除细胞内的活

1.4 小结

本部分的实验研究从地塞米松可以引起细胞内活性氧增高的角度，从体外实验的角度来探索激素性骨质疏松的发病

二、特立帕肽对大鼠AKT通路以及骨质疏松的影响

2.2结果

图2.2，CCK-8测定细胞的增殖能力，可以发现特立帕肽能够促进细胞的增殖，逆转地塞米松的副作用。C

2.2.3 细胞内活性氧的测定结果

取造模SD大鼠的股骨组织，使用RT-PCR的方法检测细胞内SOD2 mRNA的表达，结果发现在地塞

实验中使用RT-PCR的方法检测了细胞内CAT mRNA的表达，我们发现在对照组CAT的表达量要明