调控小胶质细胞ZEB1对急性缺血性脑卒中后炎症损伤机制的研究

摘要

目的：小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，占中枢神经系统细胞总数的10%。小胶质细胞像哨兵一样守护着中枢神经系统稳态的平衡，在正常状态下，小胶质细胞通过由胞体伸出的突触不断运动以检测周围环境，及时发现脑内环境的变化，以维持脑内稳态。研究表明，小胶质细胞在神经系统发育、维持中枢神经系统稳态、免疫炎症以及神经修复有重要作用。在急性缺血性脑卒中后，损伤的脑组织可以释放出大量危险相关信号分子、氧自由基等，小胶质细胞针对脑内微环境的变化可以迅速活化，迅速增殖并迁移到损伤区域，产生多种促炎或者抗炎细胞因子，然而活化后的小胶质细胞影响缺血性脑卒中后炎症反应的具体机制目前尚不明确。因此，了解小胶质细胞的作用机制对于调控卒中后小胶质细胞反应，从而减轻脑损伤有重要指导作用。Zinc finger E-box-binding homeobox1（ZEB1）是哺乳动物中普遍存在的转录因子，在免疫系统发生发展、肿瘤的发生以及肿瘤细胞耐药性等方面发挥重要作用，影响多种病理生理功能。进行前期探索后发现，急性缺血性脑卒中后ZEB1含量明显升高，且主要来源是小胶质细胞。本实验通过构建小胶质细胞特异性过表达或者低表达ZEB1的条件性转基因小鼠，旨在探寻影响小胶质细胞中ZEB1在急性缺血性脑卒中后发挥作用的具体机制，这一研究将对完善小胶质细胞功能以及卒中后免疫炎症机制提供新的证据，为卒中后免疫治疗提供新的思路。 方法：（1）构建大脑中动脉缺血/再灌注模型，研究ZEB1含量的变化，并通过分离中枢神经系统的不同细胞来寻找ZEB1的主要细胞来源。（2）根据上述结果构建小胶质细胞特异性敲除（ZEB1-KD）或者过表达ZEB1(ZEB1-TG)小鼠，并诱导急性脑缺血/再灌注模型，通过神经功能评分、梗死体积、血脑屏障完整性、凋亡细胞数目来评价脑损伤程度，研究ZEB1对缺血性脑卒中的影响。（3）通过对小胶质细胞进行三维重建形态分析探究ZEB1对其静息状态下形态的影响；诱导缺血性脑卒中模型后研究条件性敲除或者过表达小鼠小胶质细胞的形态，分析其活化程度。（4）在利用条件性敲除或过表达小鼠诱导缺血性脑卒中模型后，将中枢神经系统的小胶质细胞利用CX3CR1磁珠分选试剂盒进行分选后，对其进行基因芯片全基因组检测后进行富集分析，分析其主要的影响的生物学功能。（5）利用流式细胞分析术（FACS）对条件性敲除与过表达小鼠中枢神经系统各个免疫细胞亚群进行分析。（6）通过免疫荧光染色和荧光定量PCR检测条件性过表达或者敲除小鼠中枢神经系统趋化因子表达变化。（7）通过Transwell实验研究中枢固有细胞（小胶质细胞，星形胶质细胞）对中性粒细胞的趋化作用，寻找ZEB1影响影响免疫细胞趋化的机制。（8）通过PCR检测中枢神经系统分泌的炎症因子的变化，利用不同炎症因子的抗体中和其影响研究炎症因子对中性粒细胞趋化的影响。（9）利用染色质免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告技术研究ZEB1影响炎症因子表达的具体分子机制。（10）利用腺相关病毒对转基因小鼠以及野生型小鼠进行脑实质注射以达到阻断TGF-b1受体，诱导卒中模型，探究其神经功能评分以及梗死体积变化以及对中性粒细胞趋化的影响。 结果：（1）在小鼠急性缺血性脑卒中后，在梗死侧缺血半暗带区域ZEB1的含量在mRNA水平和蛋白水平较健康侧升高；进而分离出中枢神经系统的三种主要细胞—神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞后并对其进行氧糖剥夺，发现小胶质细胞中ZEB1升高最明显。（2）分离出小胶质细胞并进行低氧低糖处理后，随着低氧低糖时间的延长，ZEB1表达水平升高，恢复正常氧糖含量进行培养后，ZEB1含量恢复到基线水平。（3）利用构建的小胶质细胞中ZEB1过表达以及低表达小鼠进行缺血性脑卒中处理，结果显示ZEB1-TG小鼠表临床症状、梗死体积较野生型小鼠减轻，而ZEB1-KD小鼠临床评分、梗死体积较野生型小鼠加重。在诱导缺血性卒中后，ZEB1-TG小鼠的凋亡细胞较野生型小鼠减少而ZEB1-KD小鼠的凋亡细胞增多；ZEB1-TG小鼠血脑屏障通透性较野生型小鼠改善，ZEB1-KD小鼠血脑屏障破坏更加严重。（4）通过分析小胶质细胞形态后发现，ZEB1-TG小鼠的小胶质细胞突触的复杂性较野生型小鼠增多；诱导缺血性卒中后，ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠以及野生型小鼠活化的小胶质细胞数目、突出长度、阿米巴状细胞比例无明显差异；通过对小胶质细胞胞体长度（L）以及面积（A）比例的分析来测量其活化程度，ZEB1-TG小胶质细胞活化程度较野生型小胶质细胞减低，ZEB1-KD小胶质细胞表现出相反的趋势；ZEB1-TG、ZEB1-KD、野生型小鼠的小胶质细胞增殖凋亡数目无明显差异。（5）诱导缺血性脑卒中后，将ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠、野生型小鼠的小胶质细胞分离出来进行基因芯片分析，三者有不同的基因表达谱；对差异基因进行富集分析后，主要富集的通路集中在免疫功能上。（6）对ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠、野生型小鼠进行免疫细胞亚群分析后发现缺血性脑卒中后浸润到中枢的中性粒细胞存在最明显的差异。（7）ZEB1-TG小鼠在诱导缺血性卒中后，中性粒细胞趋化因子CXCL1含量较野生型小鼠明显减低，且CXCL1主要存在于星形胶质细胞中。（8）在Transwell实验中，星形胶质细胞单独存在的情况下ZEB1-TG小鼠和野生型小鼠对于中性粒细胞的趋化能力并无明显差别；当小胶质细胞和星形胶质细胞共同存在的情况下，ZEB1-TG小胶质细胞和星形胶质细胞对于中性粒细胞的趋化能力明显下降，CXCL1的含量明显降低。此抑制作用主要是由于过表达小胶质细胞可以分泌较多的TGF-β1导致的。（9）ZEB1可以和TGF-β1启动子区域结合，激活TGF-β1的转录。（10）将shTGF-bRⅡ腺相关病毒脑实质注射后，阻断星形胶质细胞的TGF-β1信号通路，此时诱导缺血性脑卒中模型，ZEB1-TG小鼠与野生型小鼠梗死体积、临床评分、对中性粒细胞趋化能力无明显差别。 结论：ZEB1在急性缺血性脑卒中后表达水平明显升高，在小胶质细胞中尤为明显。在小胶质细胞中过表达ZEB1可以减轻急性缺血性脑卒中后的脑损伤；过表达ZEB1的小胶质细胞突触的复杂性以及缺血性脑卒中后的免疫调节功能显著增高；ZEB1改善卒中预后的机制可能是由于改善卒中后炎症微环境导致的。ZEB1高表达的小胶质细胞可分泌大量的TGF-β1,抑制星形胶质细胞分泌中性粒细胞趋化因子CXCL1，降低了急性期中性粒细胞向中枢神经系统的浸润；而敲低ZEB1则会加重缺血性脑卒中损伤。基于此实验结果推断ZEB1是缺血性脑卒中后小胶质细胞调控炎症反应的重要因子，有可能成为卒中后免疫干预的重要靶点。

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