HOTTIP通过HBV DNA聚合酶-CREB1-HOXA13轴调节病毒的复制

摘要

目的： 长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度大于200个核苷酸且无蛋白质编码潜力的内源性RNA分子。近年来研究显示，LncRNA在各种生物学过程中发挥着至关重要的重要的作用，但是关于其与HBV（hepatitis B virus）感染的报道却寥寥无几。HBV感染可严重危害人类健康。据报道一些LncRNA与感染和HBV相关疾病有关，但其潜在机制尚不清楚。为了研究LncRNA在HBV感染中的作用，前期我们通过深度测序获得了HBV-HCC（hepatpcellular carcinoma，肝细胞肝癌）LncRNA图谱，其中发现LncRNA HOTTIP呈明显高表达水平。本研究旨在探索HOTTIP在HBV阳性细胞中高表达的机制及其对HBV病毒基因组复制，病毒抗原水平及HBV相关启动子的影响。从而解释HOTTIP在HBV感染中的作用机制及调控通路。这将有助于我们了解HBV发病机制的分子机制，并为临床治疗HBV提供新线索。 方法： 首先，通过RT-qPCR检测HOTTIP在HBV阳性和HBV阴性的HCC组织及相关肝癌细胞系中的表达情况。为进一步证明HOTTIP是由HBV诱导的，我们在Huh7细胞中瞬时转染pHBV1.3的质粒检测HOTTIP的水平。进一步利用Southern blot印迹实验、酶联免疫实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、RT-qPCR、双荧光报告系统及病毒学相关实验检测HOTTIP对病毒基因组复制，病毒抗原水平和HBV相关启动子的影响。为了解析HOTTIP的具体作用机制，在Huh7细胞中瞬时转染HBV编码各蛋白质粒，RT-qPCR和双荧光报告系统检测HOTTIP的mRNA和HOTTIP启动子的表达水平，结合Western blot实验进而证实了HBV DNA聚合酶可诱导HOTTIP的表达。其次，为了探索HBV DNA聚合酶诱导HOTTIP表达的具体机制，我们利用生物信息学方法预测HOTTIP启动子上的转录因子，并运用Western blot、RT-PCR、双荧光报告系统证实HBV DNA聚合酶通过CREB1来诱导HOTTIP的水平。此外，Western blot和RT-qPCR检测HOTTIP对HOXA13表达情况的影响。最后，利用Southern blot实验、酶联免疫实验、RT-qPCR、双荧光报告系统检测HOXA13对病毒基因组复制，病毒抗原水平和HBV相关启动子的影响。 结果： RT-qPCR实验结果显示HOTTIP在HBV阳性的HCC组织中呈较高表达水平。此外，与正常肝癌细胞相比HOTTIP在能稳定分泌病毒颗粒的HepG2.2.15中呈更高的表达水平。与对照组相比，瞬时转染pHBV1.3质粒后HOTTIP表达水平明显增高。这些结果与深度测序结果一致。Huh7细胞中转染HBV DNA聚合酶后HOTTIP mRNA及HOTTIP启动子表达水平增加，表明HBV DNA聚合酶可诱导HOTTIP的高表达。生物信息学及RT-qPCR和双荧光报告系统证实了HBV DNA聚合酶通过上调CREB1的表达来诱导HOTTIP的高表达。病毒学实验表明HOTTIP抑制病毒基因组复制，病毒抗原水平和HBV启动子Enh/xp的水平。此外，Western blot及RT-qPCR实验证明HOTTIP可上调HOXA13的表达。最后，进一步病毒学实验证明HOXA13抑制病毒基因组复制，病毒抗原水平和HBV启动子Enh I/Xp的水平。最终证实了HOTTIP是通过HBV DNA聚合酶-CREB1-HOXA13通路来发挥其抗病毒作用。 结论： 本研究发现了LncRNA HOTTIP新的抗病毒的调控通路。结果表明，HOTTIP通过HBV DNA聚合酶-CREB1-HOXA13通路在HBV感染中发挥着抑制病毒复制的作用。

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Abstract

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、HOTTIP由HBV诱导并在HBV感染后明显上调

1.1材料和方法

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.1.3统计学方法

1.2结果

1.2.1 HOTTIP在HBV（-）和HBV（+）的HCC组织中呈差异性表达。

1.2.2 RT-qPCR 验证HOTTIP在肝癌细胞中的差异表达。

1.3小结

二、HBV DNA聚合酶通过调控CREB1诱导HOTTIP的表达

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3统计学方法

2.2结果

2.2.1双荧光报告系统验证HOTTIP启动子的发光性

2.2.2 HBV DNA 聚合酶诱导HOTTIP的表达

2.2.3 CREB1上调HOTTIP的表达

2.2.4 HBV DNA聚合酶上调CREB1的表达

2.3小结

三、HOTTIP抑制HBV的复制

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.1.3统计学方法

3.2结果

3.2.1 HOTTIP过表达和敲降质粒有效性验证

3.2.2 HOTTIP可抑制HBV启动子Enh I/Xp的活性

3.2.3 过表达HOTTIP抑制、敲降HOTTIP促进Huh7细胞的HBsAg和HBeAg的表达水

3.2.4 过表达HOTTIP抑制、敲降HOTTIP促进HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeA

3.2.5 过表达HOTTIP抑制、敲降HOTTIP促进Huh7细胞的HBV总RNA和pg RNA的

3.2.6 过表达HOTTIP抑制、敲降HOTTIP促进HepG2.2.15细胞的HBV总RNA和p

3.2.7 过表达HOTTIP抑制、敲降HOTTIP促进Huh7和HepG2.2.15细胞的HBV

3.2.8 过表达HOTTIP抑制，敲降HOTTIP促进HBV复制中间体的表达

3.3小结

四、HOXA13抑制HBV的复制

4.1材料和方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.1.3统计学方法

4.2结果

4.2.1 HOXA13过表达和敲降质粒有效性验证

4.2.2过表达HOXA13抑制、敲降HOXA13促进Huh7细胞的HBsAg和HBeAg的表达水平

4.2.3 过表达HOXA13抑制、敲降HOXA13促进HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeA

4.2.4 过表达HOXA13抑制、敲降HOXA13促进Huh7细胞的HBV总RNA和pg RNA的

4.2.5 过表达HOXA13抑制、敲降HOXA13促进HepG2.2.15细胞的HBV总RNA和p

4.2.6 过表达HOXA13抑制、敲降HOXA13促进Huh7和HepG2.2.15细胞的HBV

4.2.7 HOXA13可抑制HBV启动子Enh I/Xp的活性

4.3小结

五、HOXA13介导HOTTIP对HBV 复制的作用

5.1材料和方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.1.3统计学方法

5.2结果

5.2.1 过表达HOTTIP增强、敲降HOTTIP抑制HOXA13的表达水平

5.2.2 PROMO软件预测Enh I/Xp上有一个潜在HOXA13结合位点

5.2.3 HOTTIP过表达和敲降对突变HOXA13结合位点的HBV Enh I/Xp启动子无影响

5.2.4 HOXA13过表达和敲降对突变HOXA13结合位点的HBV Enh I/Xp启动子无影响

5.4小结

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

长非编码RNA与病毒

综述参考文献

致谢

个人简历