Sestrin2在有氧运动改善增龄性骨骼肌萎缩过程中的作用

摘要

研究目的: 随着全球人口老龄化的迅速加剧,由增龄诱发的多种代谢性疾病越发受到关注.增龄性骨骼肌萎缩(指与年龄相关的渐进性骨骼肌丢失与功能下降)对老年人健康产生多种负面影响,而规律运动则可显著延缓老年人骨骼肌萎缩,但其机制尚不明确.增龄性骨骼肌萎缩与骨骼肌细胞衰老密切相关,有学者认为异常线粒体在骨骼肌细胞内的堆积是促进骨骼肌细胞衰老的重要因素.在衰老过程中堆积的异常线粒体DNA、受损的线粒体蛋白、氧化呼吸链过度产生的活性氧(ROS)都可加速骨骼肌细胞衰老.此外,有研究发现在衰老骨骼肌细胞线粒体融合、分裂比例失衡,线粒体融合相对增多导致巨大线粒体的产生,并且由于线粒体自噬水平下降,受损线粒体无法及时清除,致使受损巨大线粒体对骨骼肌细胞产生严重破坏,这可能是增龄性骨骼肌萎缩的关键诱因之一. Sestrins是一类具有抗衰老作用的应激诱导蛋白,可通过其自身抗氧化作用清除细胞内多余的氧化自由基,并且调控细胞内AMPK,mTOR等能量感受信号蛋白,调节细胞代谢.此外,研究发现Sestrins与细胞自噬活动密切相关,而在衰老骨骼肌细胞由于受损线粒体大量堆积,因此Sestrins的抗氧化及促自噬功能可能在保护衰老骨骼肌受损线粒体中发挥重要作用,其具体调控机制亟需深入研究.本课题将重点探讨Sestrins与衰老骨骼肌中线粒体的相互作用关系,以期为揭示Sestrins在运动改善增龄性骨骼肌萎缩的机制提供理论依据. 研究方法: (1)动物模型:3月龄C57BL/6青年雄性小鼠(YS)8只,12月龄C57BL/6老年雄性小鼠16只,随机分为老年安静对照组(OS)、老年运动组(OE).此外,选用3月龄雄性野生型以及AMPKα2基因敲除鼠各8只,随机分为安静组和运动组.运动干预结束后行肌力测试、体成分分析、称量体重,随后处死取材; (2)运动方案:老年运动组干预时间为8个月,AMPKα2基因敲除鼠运动组干预时间为6周,运动形式为75%VO2max强度的有氧跑台运动,坡度为0,60分/次,1次/天,5次/周; (3)体成分检测:运动干预结束后使用"ImpediVET实验动物体组成测定分析仪"输出体质指数,去脂体重,体脂含量等指标,随后进行统计分析; (4)电镜观察:在小鼠处死后,迅速分离腓肠肌,经2.5%戊二醛和1%锇酸固定、酒精和丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋、制备超薄切片,并在30000倍视野下观察线粒体形态; (5)细胞培养:C2C12肌原细胞经含2%马血清的1×DMEM诱导分化为肌管细胞,应用Sesn1-siRNA、Sesn2-siRNA干预细胞,采用活性氧检测试剂盒检测干预后细胞ROS水平,后提取细胞蛋白; (6)取小鼠腓肠肌,经4%中性甲醛固定、酒精梯度脱水、石蜡包埋、制备5μm切片,而后组织进行HE染色,光镜下观察各组小鼠腓肠肌横截面积; (7)Western blot法检测骨骼肌组织或C2C12细胞Sesn1,Sesn2,Sesn3,pAMPK-Thr172,Drp1,Mfn2,Pink1,p62,PGC-1α,COX4,IL6及TNF-α蛋白表达水平. 研究结果: (1)长期有氧运动对小鼠增龄过程中体重增加无显著影响,但可增加老年小鼠腓肠肌与体重比、去脂体重、抓力、抓力与体重比、腓肠肌肌纤维横截面积,降低脂肪含量,减少衰老骨骼肌中炎症因子(TNF-α)的产生; (2)长期有氧运动可有效减少衰老骨骼肌中巨大线粒体的产生,同时增加线粒体功能相关蛋白Drp1,Mfn2,PGC-1α及COX4,以及线粒体自噬蛋白Pink1的表达,降低P62表达; (3)老年小鼠骨骼肌中Sesn1和Sesn2的表达量下降而Sesn3表达无显著变化,其中抑制Sesn1表达对线粒体调节相关蛋白表达无显著影响,而抑制Sesn2表达可显著降低线粒体相关蛋白Drp1,PGC-1α及COX4表达,并且使线粒体促融合、分裂蛋白Mfn2、Drp1比例失调,融合指数升高.线粒体自噬蛋白Pink1表达下降,P62堆积增多.此外,抑制Sesn2表达还可增加肌管细胞内ROS水平; (4)AMPK敲除小鼠骨骼肌Drp1表达无显著变化,而Mfn2表达显著下降,此外Pink1蛋白含量下降. 研究结论: (1)长期有氧运动可延缓或改善老年小鼠增龄性骨骼肌萎缩发生、降低衰老骨骼肌中低炎症反应状态; (2)长期有氧运动可促进骨骼肌细胞线粒体生成、改善线粒体功能、提高线粒体自噬、并降低异常线粒体的产生; (3)Sesn2可通过调节肌管细胞线粒体的多种功能、减少细胞ROS的产生,从而改善衰老过程中骨骼肌细胞线粒体异常; (4)AMPK可能介导骨骼肌细胞Sesn2促进细胞线粒体融合和线粒体自噬的作用.

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