NOX/NADPH氧化酶介导的ROS在激素诱导成骨细胞凋亡过程中作用机制的研究

摘要

目的： 成骨细胞作为骨组织形成与修复的重要细胞与激素性股骨头坏死关系密切，研究发现糖皮质激素的过量应用可引起骨组织受到氧化性损伤，造成成骨细胞凋亡，而氧自由基（reactive oxygen species,ROS）作为介导氧化应激性损伤的重要分子，其在激素诱导成骨细胞凋亡过程的来源及作用机制尚未明确，本实验通过体外建立高浓度地塞米松（dexamethasone,DEX）环境，探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-reduced,NADPH）氧化酶（NADPH oxidase,NOX）介导的ROS生成对成骨细胞凋亡的影响机制。 方法： 取第3代小鼠MC3T3-E1成骨细胞，设空白对照组；地塞米松组（DEX组）；地塞米松+ROS清除剂（N-乙酰半胱氨酸,NAC）组（DEX+NAC组）；NAC组；地塞米松+NOX抑制剂（二亚苯基碘，DPI）组（DEX+DPI组）；DPI组。按实验分组干预培养24h， 1.倒置显微镜下观察成骨细胞形态。 2.MTT法检测成骨细胞活性。 3.免疫荧光染色检测成骨细胞内ROS的生成。 4.Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测成骨细胞凋亡。 5.荧光定量PCR及Western-Blot检测NOX1，NOX2和NOX4基因和蛋白的表达。 6.通过小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）分别靶向沉默细胞内NOX1,NOX2和NOX4的表达后，实验按空白对照组、阴性对照组(空质粒处理，NC组)、地塞米松组（DEX组）、siRNA组、DEX+siRNA组干预培养24h，进一步通过免疫荧光染色检测细胞内ROS的生成,TUNEL染色检测成骨细胞凋亡。 结果： 1.倒置相差显微镜下观察及MTT结果提示，与空白对照组相比，DEX组成骨细胞出现明显的皱缩、变形，细胞活性显著降低，加入NAC或DPI后细胞形态良好，生长旺盛，细胞活性明显升高，差异存在统计学意义（P＜0.05）。 2.免疫荧光检测ROS生成及流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：DEX组成骨细胞内ROS生成和细胞凋亡均较空白对照组显著提高（P＜0.05），与DEX+NAC组结果和DEX+DPI组结果相比，NAC或DPI显著降低了成骨细胞内ROS的产生及成骨细胞凋亡（P＜0.05）。 3.荧光定量PCR及Western-Blot检测显示DEX组NOX1和NOX4的mRNA及蛋白表达较空白对照组明显增加（P＜0.05），而NOX2的表达无统计学差异（P＞0.05）。 4.通过siRNA分别靶向沉默成骨细胞内NOX1,NOX2和NOX4的表达，进一步实验结果提示与DEX组比较，NOX1siRNA+DEX组和NOX4siRNA+DEX组成骨细胞内ROS的生成明显降低（P＜0.05），而NOX2siRNA+DEX组成骨细胞内ROS的生成与DEX组相比，无统计学差异（P＞0.05）。 5.沉默NOX1、NOX2和NOX4的表达，进一步实验通过TUNEL染色观察成骨细胞凋亡，结果提示与DEX组比较，NOX1siRNA+DEX组和NOX4siRNA+DEX组成骨细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），而NOX2siRNA+DEX组成骨细胞凋亡率与DEX组相比，无统计学差异（P＞0.05）。 结论： 体外高浓度地塞米松环境下，成骨细胞内NOX1和NOX4mRNA和蛋白的表达显著性升高，其介导的ROS生成造成大量成骨细胞凋亡，而NOX2的表达未见明显变化，NOX1和NOX4可能成为激素性股骨头坏死早期治疗的重要靶点。

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