SPR生物传感器用于胰岛素样生长因子-1受体信号通路蛋白相互作用研究

摘要

表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)生物传感器技术因其实时、快速、无需标记的特点已广泛用于研究生物分子之间相互作用的动力学过程。本文采用SPR生物传感器技术研究胰岛素样生长因子-1受体上游蛋白相互作用，研究内容包括：胰岛素受体底物(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3-K)与磷酸化或非磷酸化胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor receptor-1，IGF-1R)的结合解离动力学；Mg2+、Mn2+、ATP、激酶抑制剂染料木黄酮和槲皮素存在时，IRS-1和PI3-K与IGF-1R的相互作用变化；来源于IGF-1R的磷酸化多肽(IGF-1R多肽)对IRS-1/IGF-1R结合影响，并探讨了IRS-1对PI3-K与IGF-1R直接结合的影响以及三者结合模型；建立基于SPR传感芯片表面的IGF-1R多肽的磷酸化-去磷酸化开关技术平台，应用此技术平台研究IGF-1R多肽与下游蛋白相互作用和酪氨酸激酶反应。论文工作得到以下结果：
　　 1.固定于CM5芯片表面的抗IGF-1Rα亚基单克隆抗体特异性地捕获了过表达IGF-1R细胞裂解液中的IGF-1R，此捕获的受体成功地用于与IRS-1和PI3-K的相互作用研究。
　　 2.IGF-1R受体磷酸化提高了其与IRS-1结合速率，引起IGF-1R/IRS-1亲和力增强10.8倍，Mg2+、Mn2+进一步提高了IRS-1与磷酸化IGF-1R的结合解离速率。激酶抑制剂染料木黄酮和槲皮素表现出与ATP相同的影响趋势，分别使亲和常数下降6.0、6.6和4.7倍。IGF-1R磷酸化多肽竞争性抑制IRS-1与IGF-1R的结合。
　　 3.PI3-K和IGF-1R可以直接结合，较之于非磷酸化受体，磷酸化的IGF-1R与PI3-K的亲和常数增强了20.5倍，Mg2+进一步提高了PI3-K与磷酸化IGF-1R的结合速率。ATP存在下两者的亲和力不变，但结合与解离速率常数都有所提高。激酶抑制剂染料木黄酮和槲皮素与ATP表现出不同的趋势，两者使PI3-K/IGF-1R的结合速率降低。通过PI3-K、IRS-1和抑制IRS-1与IGF-1R直接结合的IGF-1R多肽共孵育来研究IRS-1对PI3-K和IGF-1R结合的影响，IRS-1促进了PI3-K与IGF-1R的结合，表明三个蛋白质间两两之间可能都有相互作用。
　　 4.在激酶反应条件下，过表达IGF-1R的细胞裂解液使芯片表面的非磷酸化模拟受体多肽磷酸化，表现出一定的受体酪氨酸激酶-底物特异性、酪氨酸磷酸化水平-孵育时间依赖性、磷酸化水平检测的抗体浓度依赖性、激酶抑制剂对磷酸化抑制的浓度依赖性。固相磷酸化多肽可用于与IRS-1相互结合研究。磷酸化多肽表面能被白细胞特异性抗原酪氨酸磷酸酶完全去磷酸化，且1 mM的磷酸酶抑制剂正钒酸钠可抑制此去磷酸化过程，实现了传感芯片表面的磷酸化-去磷酸开关技术平台建立和应用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略符号说明

声明

第一章绪论

1.1表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术

1.1.1SPR生物传感器的历史

1.1.2SPR生物传感器的基本原理

1.1.3SPR生物传感器的基本结构

1.1.4SPR生物传感器的发展趋势

1.1.5SPR生物传感器在药物筛选中的应用

1.2胰岛素样生长因子-1受体信号通路的早期活动

1.2.1胰岛素样生长因子-1及其受体

1.2.2胰岛素样生长因子-1受体信号通路

1.2.3胰岛素样生长因子-1信号通路中上游蛋白相互作用研究

1.2.4胰岛素样生长因子-1信号通路中上游蛋白相互作用研究方法

1.3本工作的目的和思路

第二章胰岛素样生长因子-1受体与胞内蛋白相互作用研究的方法学建立

2.1引言

2.2实验设计

2.2.1实验设备

2.2.2实验试剂

2.2.3过表达IGF-1R的NIH3T3细胞培养、裂解液制备

2.2.4免疫共沉淀和免疫印迹检测IGF-1R表达及其磷酸化水平

2.2.5抗体固定以及IGF-1R捕获于芯片表面

2.2.6IGF-1R磷酸化对IRS-1和PI3-K与IGF-1R结合的动力学及亲和力影响

2.2.7各种影响因素存在下的IRS-1和IGF-1R结合动力学和亲和力研究

2.3SPR数据分析[112]

2.3.11：1Langmuir模型

2.3.2平行反应模型

2.3.3构象变化模型

2.3.4存在传质效应的1：1Langmuir模型

2.3.5竞争结合模型

2.3.6平衡态结合模型

2.4实验结果

2.4.1IGF-1R表达及其磷酸化水平检测

2.4.2抗IGF-1Rα-亚基抗体的固定和IGF-1R的捕获

2.4.3传感芯片表面IRS-1与IGF-1R结合的特异性

2.4.4各种影响因素存在下的IRS-1和IGF-1R相互作用研究

2.5小结

第三章受体磷酸化、Mg2+、Mn2+、ATP、染料木黄酮和槲皮素对IRS-1和IGF-1R结合动力学及亲和力影响研究

3.1引言

3.2实验结果和讨论

3.2.1IGF-1受体磷酸化对IGF-1R和IRS-1相互作用动力学及亲和力影响

3.2.2Mg2+和Mn2+存在下IGF-1R与IRS-1预稳态结合动力学分析

3.2.3Mg2+和Mn2+存在下IRS-1与IGF-1R平衡态结合动力学分析

3.2.4ATP、染料木黄酮或槲皮素存在下IRS-1与IGF-1R结合动力学及其分析

3.3小结

第四章受体磷酸化、Mg2+、ATP、染料木黄酮、槲皮素和IRS-1对PI3-K和IGF-1R直接结合的影响

4.1引言

4.2实验仪器、材料和方法

4.2.1仪器

4.2.2免疫印迹(Western blotting)

4.2.3免疫沉淀

4.3实验结果与讨论

4.3.1IGF-1刺激前后PI3-K、IRS-1与IGF-1R的免疫共沉淀及三者磷酸化水平变化

4.3.2PI3-K与磷酸化或非磷酸化的IGF-1R的直接结合研究

4.3.3Mg2+和ATP存在下的PI3-K与磷酸化的IGF-1R结合动力学变化

4.3.4激酶抑制剂染料木黄酮和槲皮素存在下的PI3-K与磷酸化的IGF-1R的直接结合动力学变化

4.3.5IGF-1R来源的磷酸化多肽对IRS-1/IGF-1R相互结合的影响

4.3.6IRS-1对PI3-K/IGF-1R相互作用的影响

4.4小结

第五章传感芯片表面多肽磷酸化-去磷酸化开关技术平台建立及其应用

5.1前言

5.1.1蛋白激酶

5.1.2去磷酸化酶

5.1.3信号通路中蛋白磷酸化研究方法的现状

5.1.4胰岛素样生长因子-1信号通路中的酪氨酸磷酸化与去磷酸化事件及其在药物筛选中的应用

5.1.5基于SPR生物传感器的蛋白磷酸化-去磷酸化开关研究方法及其应用

5.2实验部分

5.2.1仪器与试剂

5.2.2实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1多肽在芯片表面的酪氨酸磷酸化及其检测

5.3.2酪氨酸磷酸化多肽与下游蛋白IRS-1结合反应及其动力学研究

5.3.3表面失去生物活性的CM5芯片从头再生及表征结果

5.3.4芯片表面的酪氨酸磷酸化多肽的去磷酸化及其检测

5.3.5商品化芯片之间、再生芯片之间以及多次磷酸化-去磷酸化后芯片之间的差异性研究

5.3.6传感芯片表面多肽磷酸化过程用于激酶抑制剂作用研究

5.4小结

第六章总结和展望

参考文献

博士期间发表文章

申请专利

致谢

个人简历