南方红豆杉细胞中紫杉烷生物合成途径及其诱导调控研究

摘要

以悬浮培养南方红豆杉T系细胞为例,围绕红豆杉细胞中紫杉烷生物合成过程中重要前体物3-异戊烯基焦磷酸(IPP)的生物代谢路径以及紫杉烷合成中细胞色素P-450单体加氧酶的重要作用,利用抑制剂阻断代谢路径法,开展了以下相关研究工作:首先利用代谢抑制剂阻断法考察了正常培养条件下紫杉烷生物合成过程中重要前体物3-异戊烯基焦磷酸(IPP)的代谢路径.结果表明在不同细胞生长时期IPP代谢路径有较大差异:利用细胞表态学和活性测定以及诱导模型参数分析等手段,研究了诱导子甲基茉莉酮酸(methyI jasmonate,MJ)对细胞代谢过程的影响特点及作用规律.进一步利用代谢抑制剂法,通过抑制率和诱导率分析,考察了MJ对IPP生物代谢路径的诱导调控情况.结果表明在细胞生长晚期MJ对不同紫杉烷合成过程中IPP的代谢路径具有不同诱导行为:利用代谢抑制剂阻断法,考察了水杨酸(salicylic acid,SA)对IPP生物代谢路径的诱导行为作为MJ诱导作用的对比研究.结果表明在细胞生长晚期10-DAB、Taxol和Cephalomannine的生物合成过程中,SA对质体中的非甲羟戊酸途径合成IPP有较强诱导作用;在Taxol合成过程中,SA对IPP从细胞质到质体的转运路径有较强诱导.研究中进一步采用专一性酶抑制剂法,仍选用MJ和SA,考察了对紫杉烷合成过程中细胞色素P-450单体加氧酶的活性,这种作用在细胞生长早期表现尤为显著.在研究紫杉烷类生物合成中的IPP生物代谢途径及其诱导调控的基础上,建立了植物细胞合成紫杉烷的初步理论代谢模型.通过模型中代谢通量扰动因子的求解与分析,从碳通量变化的角度揭示了紫杉烷类生物合成的运行机制.

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1引言

1.2紫杉烷生物合成研究进展

1.2.1紫杉烷结构及性质

1.2.2紫杉烷的生物合成途径

1.2.3紫杉烷生物合成途径中的关键酶

1.3紫杉烷生物合成的调控

1.4本文的研究工作

第二章紫杉烷生物合成过程中3-异戊烯基焦磷酸代谢途径研究

2.1引言

2.2研究材料与方法

2.2.1药品配制

2.2.2细胞株系及其培养

2.2.3细胞生物量测定

2.2.4细胞活性测定

2.2.5紫杉烷类化合物的提取与检测

2.2.6实验设计

2.3结果与讨论

2.3.1紫杉烷类生物合成中IPP代谢路径研究

2.3.2紫杉烷类生物合成中IPP转运研究

2.4小结

3.1引言

3.2研究材料与方法

3.2.1药品配制

3.2.2细胞株系及其培养

3.2.4细胞活性测定

3.2.5 Evans blue检测

3.2.6电导率的测定

3.2.7酶类的提取

3.2.8可溶性蛋白质测定方法

3.2.9 PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性测定

3.2.10紫杉烷类化合物的提取与检测

3.2.11实验设计

3.3结果与讨论

3.3.1 MJ对红豆杉细胞基本代谢的影响

3.3.2诱导模型及MJ对紫杉烷类生物合成的诱导作用评价

3.3.3 MJ对IPP生物合成的促进作用

3.3.4 MJ对IPP转运的促进作用

3.3.5 SA对红豆杉细胞基本代谢的影响

3.3.6 SA对紫杉烷类生物合成的诱导作用评价

3.3.7 SA对IPP生物合成的促进作用

3.3.8 SA对IPP转运的促进作用

3.4小结

第四章紫杉烷类生物合成过程中细胞色素P-450加氧酶的诱导调控研究

4.1引言

4.2研究材料与方法

4.2.1药品配制

4.2.2细胞株系及其培养

4.2.3细胞活性测定

4.2.4紫杉烷类化合物的提取与检测

4.2.5实验设计

4.3结果与讨论

4.3.1细胞生长早期P-450酶在紫杉烷合成中的作用

4.3.2细胞生长晚期P-450酶在紫杉烷合成中的作用

4.3.3 MJ对细胞生长早期紫杉烷合成中细胞色素P-450加氧酶的诱导

4.3.4 MJ对细胞生长晚期紫杉烷合成中细胞色素P-450加氧酶的诱导

4.3.5 SA对细胞生长早期紫杉烷合成中细胞色素P-450加氧酶的诱导

4.3.6 SA对细胞生长晚期紫杉烷合成中细胞色素P-450加氧酶的诱导

4.4小结

第五章紫杉烷类生物合成及其诱导调控的代谢通量变化分析

5.1引言

5.2代谢通量变化分析

5.2.1模型分析法的描述和基本假设

5.2.2代谢模型的建立

5.2.3代谢模型参数求解

5.4结果与讨论

5.4.1甲基茉莉酮酸作用下碳通量的改变

5.4.2水杨酸作用下碳通量的改变

5.4.3代谢通量模型的理论结果与实验结果的拟合

5.5小结

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

发表论文及参加科研情况

附录:缩写词及符号表

致谢