流通色谱介质的研制和生物大分子色谱分离

摘要

本文主要研究了以双乳化法制备新型流通色谱介质及其在生物大分子的分离过程中的应用. 以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,甘油溶液为超孔致孔剂,甲苯与正庚烷为微孔致孔剂,安息香乙醚为引发剂,采用双乳化法制备乳化体系,紫外光引发悬浮聚合制备出刚性双孔介质.介质明显地含有超孔与微孔.经二乙胺修饰后,获得的阴离子交换介质,对BSA的静态吸附容量与不含超孔的微孔介质接近,但在高的流速下它有比微孔介质大大高出的动态吸附容量,并用混合模型蛋白溶液来考查介质的分离效果,发现增加流动相流速对双孔介质的分离效果影响不大.再采用碳酸钙悬浮液为超孔致孔剂,环己醇和十二醇为微孔致孔剂,紫外光悬浮聚合制备出双孔介质,比使用甘油溶液为超孔致孔剂,甲苯与正庚烷为微孔致孔剂制备双孔介质,并使制备过程中的乳化体系更加稳定.经乙二胺修饰制得阴离子交换介质,实验证明流速对双孔介质的动态吸附容量影响更小. 为了进一步考察自制双孔介质性能,它被用来分离纯化蛋白(分子伴侣GroEL)和核酸(质粒DNA). 先发酵带有分子伴侣GroEL基因质粒的大肠杆菌,然后利用超声法对菌体进行破碎并制得澄清的待分离液,经过小量进样与梯度洗脱确定了对GroEL的洗脱条件,然后在不同的流速下(150和1500 cm/h)对分离液进行穿透吸附,并使用阶跃洗脱得到了电泳纯的GroEL产品.对于质粒DNA的分离也是先发酵带有pcDNA3质粒(5.4 kb)的大肠杆菌,利用碱裂解法制得粗提液,使用梯度洗脱的方法可以得到电泳纯的质粒DNA,并考察了流速、样品盐浓度对分离结果的影响,最后在不同的流速下(150和1500 cm/h)对粗提液进行穿透吸附,并使用阶跃洗脱法得到了电泳纯的质粒DNA产品(0.014和0.113 mg plasmid DNA/min·mL bed).从而证明了自制双孔介质能够对生物大分子进行很好的分离纯化.

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1生物技术

1.2生物分离及液相色谱技术

1.2.1离子交换色谱

1.2.2凝胶过滤色谱

1.2.3亲和色谱

1.2.4共价色谱

1.2.5疏水作用色谱

1.2.6分配色谱

1.3色谱介质

1.3.1天然高分子材料

1.3.2无机介质

1.3.3刚性有机树脂

1.4乳状液与多级乳化

1.4.1乳状液

1.4.2多级乳化

1.5 DNA药物(DNA-based Drugs)与质粒

1.5.1质粒

1.5.2基因治疗的现状

1.5.3质粒DNA的纯化

1.6流通色谱及理论

1.6.1流通色谱

1.6.2流通色谱原理

1.7本文工作的目的及内容

1.7.1研究的背景

1.7.2研究的目的

1.7.3研究的内容

第二章用甘油溶液作为致孔剂制备双孔介质

2.1引言

2.1.1光聚合原理及分类

2.1.2离子交换机理

2.2实验材料与设备

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器与设备

2.2.3溶液的配制

2.3实验方法

2.3.1双孔介质的合成

2.3.2致孔剂的去除

2.3.3微球介质的表征

2.3.4配基修饰及修饰密度的测定

2.3.5静态吸附容量的测定

2.3.6两种色谱柱的背压与流速的关系

2.3.7动态吸附容量的测定

2.3.8双孔流通色谱柱的柱效

2.3.9分离模型蛋白混合物

2.4结果与讨论

2.4.1乳化剂用量对第一次乳化液稳定性的影响

2.4.2乳化过程的测定

2.4.3双孔介质的性能测定

2.4.4微孔球的表征

2.4.5比表面积的测定

2.4.6密度的测定

2.4.7吸附容量的测定

2.4.8孔径的测定

2.4.9静态吸附容量

2.4.10流速对背压的影响

2.4.11动态吸附容量

2.4.12流速对色谱柱柱效的影响

2.4.13分离模型蛋白混合物

2.5本章小结

第三章利用碳酸钙悬浮液作为致孔剂制备双孔介质

3.1引言

3.2实验材料与设备

3.2.1实验材料

3.2.2实验仪器与设备

3.3实验方法

3.3.1碳酸钙悬浮液的制备

3.3.2利用碳酸钙悬浮液作为致孔剂制备双孔微球

3.3.3致孔剂的去除

3.3.4表面修饰

3.3.5微球介质的表征

3.3.6配基修饰及修饰密度的测定

3.3.7静态吸附容量的测定

3.3.8两种色谱柱的背压与流速的关系

3.3.8动态吸附容量的测定

3.4结果与讨论

3.4.1两类微球物理特征的比较

3.4.2流速与背压的关系

3.4.3静态吸附

3.4.4动态吸附

3.5本章小结

第四章利用双孔介质纯化分子伴侣GroEL

4.1引言

4.2实验试剂与设备

4.2.1实验试剂

4.2.2实验设备

4.2.2缓冲液的配制

4.3实验方法

4.3.1发酵培养与GroEL蛋白料液的获得

4.3.2料液蛋白浓度的测定

4.3.3色谱介质的预处理与装柱

4.3.4双孔色谱介质填充柱的分离步骤

4.3.5色谱介质填充柱分离纯化GroEL蛋白的研究

4.3.6 SDS-PAGE电泳分析方法

4.3.7料液的穿透分析

4.4结果与讨论

4.4.1梯度洗脱

4.4.2穿透点的确定

4.4.3阶跃洗脱的研究

4.5本章小结

第五章利用双孔介质纯化质粒的研究

5.1引言

5.2实验材料与设备

5.2.1实验试剂

5.2.2实验设备

5.2.3溶液的配制

5.3实验方法

5.3.1双孔介质的合成

5.3.2菌体的活化与质粒的粗提(碱裂解)

5.3.3质粒的分离

5.3.4样品的检测

5.3.5不同分子量的质粒DNA对分离结果的影响

5.3.6初始盐浓度对分离的影响

5.3.7穿透实验

5.4实验结果与讨论

5.4.1对质粒的初分离

5.4.2不同分子量大小的质粒的分离纯化

5.4.3不同进样量质粒的纯化

5.4.4不同流速质粒的纯化

5.4.5不同初始盐浓度对质粒分离的影响

5.4.6粗提液的穿透实验

5.4.7双孔介质的再生

5.5本章小结

第六章总结与展望

6.1全文结论

6.2创新点

6.3对今后工作的建议与展望

参考文献

攻读博士期间发表的论文

附录

致谢