双孔介质在高速色谱分离中的应用

摘要

本文主要研究了双孔型色谱介质在手性拆分和质粒纯化中的应用。首先以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，双甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，采用固液联合致孔方式，通过一步悬浮聚合制备了球形树脂，利用扫描电镜和压汞仪对树脂的外貌和内部孔结构进行了表征，结果表明此树脂具有双孔型结构。 以双孔型树脂为载体，以三聚氯氰为间隔臂，以牛血清白蛋白为手性配基制备了蛋白质手性色谱固定相。以d，l-色氨酸为探针，考察了pH值、流速和上样量等因素对分离性能的影响，结果表明上述因素对分离度的影响较小。当上样量为0.1mg，流速为1800cm/h时，色氨酸的分离度仍可达到1。比较了色氨酸在双孔型色谱介质上的分离度和在普通色谱固定相上分离度随流速的变化关系，结果表明在双孔型介质上的分离度受流速变化的影响较小。 在质粒的提取过程中考察了硫酸铵和氯化钙对质粒收率及对蛋白质和RNA去除效果的影响。实验发现硫酸铵是去除蛋白质和RNA的有效试剂，同时能够保持较高的质粒收率，当质粒提取液中硫酸铵的浓度达到2.5M时，质粒的纯化因子可达10.2，而质粒的收率在90％以上，氯化钙的加入也能有效去除质粒提取液中蛋白质和RNA，但是质粒的收率相对较低。 以苯酚为配基，对双孔型树脂进行修饰，制备了疏水性色谱固定相，用于质粒的纯化，优化了色谱分离条件。由于双孔型树脂中大孔的存在，提高了介质内部的传质速率，增大了对生物大分子的吸附表面，使得双孔型介质可以在高流速下进行质粒的纯化，同时保持较高的分离度。当流速为20cm/min，上样量为8mL(质粒浓度为0.32mg/mL)时，质粒的收率和质粒产品的纯度均可到达100％。 以2-巯基吡啶为配基对双孔型介质进行修饰，制得色谱固定相，并以此固定相进行质粒的纯化。考察了离子强度、pH值和配基修饰等因素对质粒分离效果的影响，从实验结果推测此介质对质粒纯化的机理基于疏水作用。当流速为20cm/min，上样量为10mL(质粒浓度为0.30mg/mL)时，质粒的收率和质粒产品的纯度均可到达100％。

目录

文摘

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第一章文献综述

1 1前言

1.2液相色谱固定相的研究进展

1.3液相色谱手性固定相的研究进展

1.4质粒DNA及核酸疫苗分离纯化的研究进展

1.5本文的主要内容

第二章蛋白质手性色谱固定相的合成及其性能

第三章硫酸铵和氯化钙对质粒提取的影响

第四章双孔型疏水性介质的制备及其对质粒的纯化

第五章以巯基吡啶为配基的固定相的制备及对质粒的纯化

第六章结论与展望

参考文献

博士期间发表的论文和参加的科研项目

附录

致谢