大肠杆菌GBP的定点突变与制备

摘要

大肠杆菌半乳糖/葡萄糖结合蛋白(galactose/glucose-binding protein，GBP)是一种专一性的半乳糖/葡萄糖结合蛋白，由mglB基因编码，成熟蛋白位于细胞的周质空间，与化学趋化作用和半乳糖/葡萄糖的主动运输有关。GBP与半乳糖/葡萄糖结合的同时伴随着酶分子的构象变化，这种构象变化可以直接或间接转化为物理信号，并被相应仪器所检测。基于GBP的这一特点所开发的葡萄糖生物传感器，具有快速、灵敏、实时和微量的特点，是临床检测糖尿病人血糖浓度的理想仪器。天然的GBP与葡萄糖的反应过于灵敏，氨基酸序列中缺乏带有巯基的半胱氨酸，缺乏与载体连接的合适极性侧链氨基酸残基，限制了其在生物传感系统中的应用。 为了降低天然GBP与葡萄糖反应的灵敏度，提高与载体的结合能力，本文通过扩增大肠杆菌的mglB基因，在三个位点上对mglB基因进行了定点突变，分别得到了E149C，A213S，L238S单点、两点和三点突变的mglB基因，并利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET28c，构建了过量表达天然和三种突变型mglB基因的重组质粒pLTMT系列和重组菌株BL21(DE3)/pLTMT系列。重组菌经摇瓶培养和IPTG诱导得到菌体，用渗透休克法提取周质空间蛋白。蛋白粗提液经Ni-NTA纯化后，得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的GBP。从500ml发酵液所获得的茵体中，可分离得到约1.68mg的GBP纯品。 为了简化GBP的分离提取工艺，本文用具有蛋白分泌系统的枯草芽孢杆菌做为表达GBP的受体菌，以实现GBP分泌型表达。利用枯草芽孢杆菌veg基因的启动子、lipA基因的信号肽序列、来自pLTMT3的的成熟GBP编码序列和His-6标签部分，构建了GBP表达质粒pHPVSG，并转化枯草芽孢杆菌DB104，得到了带有重组质粒的转化子。

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前言

第一章文献综述

1.1大肠杆菌周质空间蛋白GBP

1.1.1 GBP的生物学

1.1.2 GBP的应用

1.2大肠杆菌表达系统

1.2.1外源基因的表达

1.2.2外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位

1.2.3影响表达效率的因素

1.3 pET表达系统

1.3.1 载体

1.3.2 克隆的宿丰菌

1.3.3 表达的宿主菌

1.4周质空间蛋白分离方法

1.4.1渗透性休克法

1.4.2 EDTA-溶解酵素法

1.4.3多粘菌素硫酸盐法

1.5组氨酸标签蛋白的固化Ni2+亲和色谱纯化

1.6枯草芽孢杆菌的外源蛋白分泌表达系统

1.6.1蛋白酶缺陷菌株

1.6.2信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合

1.6.3信号肽及成熟蛋白

1.6.4分泌系统的过载

1.7重组PCR

1.8研究目的与实验策略

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要仪器

2.1.3主要药品

2.1.4培养基

2.1.5主要试剂

2.2实验方法

2.2.1染色体DNA提取

2.2.2 DNA的纯化和浓缩

2.2.3质粒的小规模CTAB提取法

2.2.4 质粒纯化试剂盒使用方法

2.2.5质粒的纯度的测定

2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2.2.7 B.subtilis Spizzen转化

2.2.8凝胶回收操作

2.2.9引物及PCR反应

2.2.10重组PCR

2.2.11定点突变

2.2.12 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.2.13 DNA的酶切与连接

2.2.14周质空间蛋白GBP的诱导表达

2.2.15粗GBP提取液的制备

2.2.16 GBP的纯化

2.2.17 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳

2.2.18考马斯亮蓝G250法测蛋白质浓度

第三章结果与讨论

3.1 mglB基因的扩增与载体构建

3.1.1 mglB基因的PCR扩增

3.1.2 重组质粒pMGLB的构建

3.2质粒pMGLB的提取和转化

3.3 mglB基因的定点突变

3.4突变型mglB基因的扩增与载体构建

3.4.1 突变型mglB基因的PCR扩增

3.4.2 重组质粒pMGLB的构建

3.5重组质粒的DNA测序鉴定

3.6重组菌的摇瓶培养及GBP的诱导表达

3.7 GBP粗提液的制备

3.8 GBP粗提液的纯化

3.9蛋白纯度的检测

3.10 GBP含量的测定

3.11枯草芽孢杆菌胞外表达GBP菌株的构建

3.11.1重组质粒pHPVSG的构建

3.11.2转化和转化子筛选

第四章结论与展望

4.1主要结论

4.2展望

参考文献

附录

致谢