铜锌超氧化物歧化酶的体外定向进化及其作为安全标记应用于植物转基因的研究

摘要

选择标记基因的安全性问题是制约转基因植物产业化的主要瓶颈之一。开发生物安全标记基因替代抗生素标记基因成为解决转基因植物安全性和促进转基因植物应用的重要策略。本研究利用体外定向分子进化技术对乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)Cu/Zn-SOD进行改造，并对以获得的高活力突变体基因为安全标记基因，百草枯(PO)为选择剂建立新型安全筛选体系的可行性进行了较为系统的研究。
　　 通过克隆乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因，并在PGK1启动子驱动下与GFP基因融合，构建YEplac195-PSGA，转化酿酒酵母W303菌株。通过菌落PCR和荧光显微观察及添加PQ进行发酵检测，结果表明乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因在酿酒酵母中成功表达。
　　 通过一步基因置换法构建酿酒酵母sodl缺失菌株LM303。首次采用酿酒酵母sodl缺失菌株作为表达宿主，通过在CM-Ura培养基中添加1 mmol/L PQ制造高氧压力，建立了Cu/Zn-SOD的高效筛选模型。
　　 通过优化易错PCR体系中Mn2+浓度，确定其最适浓度为0.5 mmol/L。经易错PCR建立突变文库进行筛选，得到三个酶活力提高的突变体S1、S2和S3(S99R/A92G，S135P，D126N)，其酶活力分别是野生酶的2.6、1.5和1.2倍。运用计算机三维结构模拟，对氨基酸置换所导致的酶分子结构变化和活力提高分子机制进行了初步分析，结果表明局部静电环境、内部氢键相互作用及活性通道的大小和形状对酶活力提高产生了重要影响。
　　 将乳酸克鲁维酵母来源的Cu/Zn-SOD和突变体S1(mSOD)基因与拟南芥谷胱甘肽还原酶叶绿体信号肽(Chl)融合，构建植物表达载体pBI121-Chl-SOD和pBI121-Chl-mSOD，并通过农杆菌介导法成功转化烟草，分别获得再生植株35和46个株系。通过PCR、RT-PCR、叶绿体SOD活性测定证明目的基因已经整合到烟草基因组中并正常定向进入叶绿体表达。转Chl-SOD和Chl-mSOD植株的SOD活性分别是野生型植株的1.8倍和5.3倍。在PO和200 mmol/L NaCl处理下，考察其对转基因植株的表观伤害、质膜透性、叶绿素a荧光动力学、抗氧化酶活性的影响，结果表明转基因植株抗氧化能力和耐盐能力有不同程度的提高，且提高大小顺序为转Chl-mSOD植株>转Chl-SOD植株>野生型植株。因此在烟草叶绿体中过表达乳酸克鲁维酵母来源的Cu/Zn-SOD和突变体S1基因能够提高转基因植株的抗氧化能力和耐盐能力。
　　 建立了以乳酸克鲁维酵母来源的Cu/Zn-SOD突变体S1(mSOD)基因作为选择标记基因，PQ作为选择剂的新型安全筛选体系。将植物表达载体pBI121-Chl-mSOD中去除nptⅡ标记基因表达盒，得到pBI121’。确定烟草遗传转化体系中PQ作为选择剂的适宜浓度为6μmol/L。在农杆菌介导的叶盘法转化烟草过程中，以mSOD基因作为选择标记基因，以6μmol/L PO为选择剂，筛选得到96株表型正常的T0代转基因植株。通过PCR、Southern blot和RT-PCR对转基因植株进行检测，结果表明mSOD基因已整合到烟草基因组中，并获得转录水平上的表达。转化频率最高为39.26％，与以nptⅡ为选择标记基因，100 mg/LKan为选择剂的传统筛选体系进行比较，转pBI121-Chl-mSOD植株和转pBI121’植株的转化频率分别是其2.16倍和2.1倍。对其遗传稳定性分析结果表明大多数T0代转基因植株为单拷贝，且表现出3:1分离方式，符合孟德尔分离定律。
　　 通过测定种子发芽率、株高、叶片数等指标，考察T0代和T1代转基因植株对PQ诱导的氧化胁迫和盐胁迫的耐受性。结果表明T0代和T1代转基因植株对PQ诱导的氧化胁迫和盐胁迫的耐受性明显高于野生型植株。
　　 此新型安全筛选体系不仅避免了使用抗生素抗性标记基因和抗除草剂标记基因，对生态环境和人类相对安全，同时具有以下优势：转化效率大大提高：获得转基因植株的周期缩短；选择标记基因可以同时为目的基因，提高转基因植物对氧化胁迫、盐胁迫的耐受性。这将对加快转基因商品化和产业化进程具有重要意义。