达托霉素次级代谢合成途径的基因工程改造

摘要

达托霉素属于A21978C家族，是一种含有13个氨基酸的大环脂肽类抗生素，在玫瑰孢链霉菌中以非核糖体蛋白合成酶机制合成。它具有依赖于Ca2+破坏病菌细胞膜的的新型作用，对许多耐药病菌有显著的灭菌活性。达托霉素作为21世纪新一代的抗生素，应用前景巨大，但目前还面临着产量低、成本高的问题。因此构建产量高、遗传稳定性好的具有我国自主知识产权的基因工程菌株，具有重要的社会意义和经济价值。
　　 由于达托霉素是次级代谢产物，提高达托霉素产量最有效的方法就是直接对其合成的次级代谢途径进行改造。所以本文主要对达托霉素合成的次级代谢途径进行改造。
　　 本文首先根据本课题组通过代谢通量分析预测的目标基因，研究过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf2，提高产还原力NADPH对达托霉素合成的影响。结果表明过表达zwf2后，达托霉素的产量从616.1 mg/L提高到673.2 mg/L，增长了10.9％。
　　 然后分别过表达ORF53、ORF54和ORF55后，达托霉素的产量分别提高11.0％，8.0％，9.2％，而同时过表达ORF53-55达托霉素的产量会进一步提高到730.2 mg/L，相比亲本株产量增加了18.5％。表明由ORF53-55编码的ATP结合转运蛋白能够促进达托霉素合成。
　　 接着根据本课题组预测的目标基因，表达了dptI和dptJ基因，通过发酵实验表明过表达后达托霉素产量分别提高了10.7％和15.2％。结合上述的过表达zwf2基因，证明了本课题组对目标基因的预测是正确的。
　　 最后将达托霉素合成基因簇上下游的附属基因dptE，dptF，dptG，dptH，dptI和dptJ基因组合过表达，基因工程菌的产量有显著的提高，达到860.5 mg/L，与出发菌株LC-54-16相比提高了39.7％，获得具有我国自主知识产权的高产达托霉素基因工程菌株。RT-PCR实验验证了过表达基因的高效表达。