γ—氨基丁酸转运蛋白亚型Ⅰ(GAT1)基因剔除小鼠系的建立与表型分析

摘要

本研究分为三部分：第一部分、GAT1基因剔除与酒精的行为作用
　　 γ—氨基丁酸能系统(GABAergicsystem)参与调节多种酒精体内作用的事实已经被广泛接受。在哺乳动物的中枢神经系统中，GABA转运蛋白亚型1(GABAtransportersubtype1，GAT1)通过其对GABA的高亲和的重摄取功能(reuptake)调节神经细胞外(突触间隙)神经递质GABA的平衡浓度，从而对保持正常的GABAergic系统功能起着非常重要的作用。本文中，我们利用传统的同源重组方法获得GAT1基因剔除小鼠，PCR和Southern-blot证明纯合子小鼠的GAT1基因缺失，RT-PCR、Western-blot证实纯合子小鼠脑中没有GAT1基因的表达，体外突触体重摄取实验证实纯合子小鼠的GABA重摄取能力显著下降；采用多种行为模型在GAT1基因缺失的杂合子和纯合子小鼠上测试了酒精作用的变化。这些测试包括：酒精、糖精和奎宁溶液的饮用量和偏爱；酒精诱导的条件性位置偏好(conditionedplacepreference，CPP)；酒精诱导的条件性味觉厌恶(conditionedtasteaversion，CTA)；酒精刺激的运动(活动)；酒精的镇静/催眠作用以及酒精的抗焦虑作用等。结果表明：与野生型小鼠相比，纯合子小鼠表现出对酒精诱导的条件性厌恶和奖赏(偏好)作用明显降低，对酒精的运动刺激作用和镇静/催眠作用的敏感性明显下降，但是增强了对奎宁溶液的回避(avoidance)此外，纯合子小鼠在高架十字迷宫(elevatedplusmaze，EPM)的测试中表现出抗焦虑样(anxiolytic-like)行为，且酒精仍可以明显地增加其在开放臂的探索时间。令人惊奇的是杂合子小鼠也表现出明显的、甚至与纯合子相反的表型：增加对酒精和糖精溶液的摄取和偏爱，同时又表现出对奎宁溶液的回避增强、对酒精诱导的CPP作用的增强、对酒精诱导的运动作用更加敏感。这些结果首次清楚地表明GAT1对酒精的某些行为上的作用具有双向调节的特性。因此，GAT1基因剔除小鼠系的建立为进一步研究酒精在生物体内的作用机制提供了一个有价值的动物模型。
　　 第二部分、GAT1基因剔除与痛觉的关系
　　 抗癫痫药物tiagabine具有镇痛作用的机制在于其能专一性地阻断GABA转运蛋白亚型I(GAT1)的重摄取，导致细胞外GABA平衡浓度上升并激活GABA的受体，从而增强GABA介导的对中枢神经系统的抑制作用。GAT1基因剔除小鼠(纯合子和杂合子)可被视为终身使用GAT1抑制剂的动物模型。本文利用四种不同的疼痛模型：甩尾试验、热板试验、扭体试验和福尔马林注射试验来考查GAT1基因剔除小鼠对这些伤害性刺激引起的痛反应是否发生变化。研究结果发现纯合子基因剔除小鼠除了对福尔马林注射引发的炎症痛的第二时相无疼痛耐受外，对其他伤害性刺激都有明显的耐受现象；基因剔除的杂合子也表现出对急性热痛的不敏感。同时，GAT1专一性抑制剂(No-711和tiagabine，10mg/kg，i.p.)在杂合子和野生型小鼠上均可在上述四种模型上表现出明显的镇痛作用，而对纯合子则无效；在两种急性热痛测试中，吗啡(5mg/kg，s.c.)对三种基因型都有显著的镇痛作用，且在甩尾测试中，吗啡的镇痛作用在纯合子和杂合子上被显著增强。此外，利用在三种不同水温中强迫游泳(4、10和33℃)诱导小鼠产生应激以考查内源性(阿片和非阿片依赖)的镇痛作用是否发生改变，结果发现杂合子和纯合子小鼠由应激诱导的镇痛作用比野生型显著增强。GABA(B)受体激动剂(baclofen，12.5mg/kg，i.p.)诱导小鼠体温降低实验说明纯合子的GABA(B)受体功能可能发生改变。这些结果表明，GAT1对于机体的疼痛反应具有重要的调节作用，下调或利用GAT1抑制剂阻断GAT1的功能可有效地减轻多种伤害性刺激引起的痛反应，GAT1的抑制剂具有明显的镇痛作用，同时也暗示长期大剂量地使用GAT1抑制剂可能会导致机体产生耐受，从而失去对持续性疼痛的治疗作用。
　　 第三部分、GAT1基因剔除对药物成瘾和认知功能的影响
　　 已有的研究表明GABA能系统在药物成瘾以及学习与记忆中起着重要的作用，而GAT1可通过对胞外GABA浓度的调节来影响药物成瘾和学习与记忆的过程。我们以前的研究显示，过表达GAT1的转基因小鼠表现出认知功能减退，且对吗啡的奖赏和生理依赖作用减弱。为了进一步地研究GAT1在药物奖赏和依赖以及认知中的作用，本文利用条件性位置偏好模型考查吗啡和可卡因对GAT1基因剔除小鼠的奖赏作用，结果发现与野生型小鼠相比：纯合子对药物的条件性位置偏好作用明显减弱，说明药物的奖赏作用降低，而与此相反，杂合子表现出更强的药物诱导的条件性位置偏好，说明其对药物奖赏作用增强。在吗啡成瘾后的戒断实验中，与野生型小鼠相比，纯合子明显减少戒断症状中的跳跃反应，而对其他戒断症状则无差异，说明纯合子对吗啡的依赖作用有一定的减弱。在两种不同的记忆模型：空间记忆模型(Morris水迷宫)和暗箱回避模型(被动回避)的测试中，与野生型小鼠相比，纯合子小鼠表现出认知能力的明显下降，而杂合子小鼠表现出认知能力的明显增强。与行为变化对应的是，在纯合子海马CA1区诱导的LTP强度明显减小，而在杂合子海马CA1区诱导的LTP强度显著增加。这些结果表明GAT1可双向调节多种药物的奖赏作用和认知功能，同时也证实药物的奖赏作用和学习记忆能力之间有明显的相关性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章　GAT1基因剔除小鼠系的建立

第二章 GAT1基因剔除小鼠对酒精的行为作用的变化

第三章 GAT1基因剔除小鼠对急性痛的敏感性下降

第四章 GABA转运蛋白亚型Ⅰ(GAT1)双向调节小鼠的认知功能以及吗啡、可卡因的奖赏作用

主要结论与展望

附录 Real-time定量PCR检验GABA系统表达水平的引物

已发表和拟发表的论文

致 谢