代谢组学分析技术在蓝细菌丁醇耐受机制研究中的应用

摘要

丁醇胁迫条件对光合蓝细菌细胞的毒害严重，阻碍了其作为工程宿主菌生产生物丁醇的发展。为了探究蓝细菌对丁醇的耐受机制，在丁醇胁迫条件下筛选了一组缺失编码反应调控因子基因的集胞藻PCC6803的突变株，与野生株相比，缺失sll0039基因的突变株在丁醇胁迫条件下生长受到抑制的程度更大，而将缺失的sll0039基因重新转入突变株中后，恢复了菌株的丁醇耐受性，这说明sll0039基因参与了集胞藻的丁醇耐受调节机制中。
　　为了进一步探究反应调控因子Sll0039在集胞藻丁醇耐受机制中起到的作用，利用基于液相-质谱联用（LC-MS）和气相-质谱联用（GC-MS）的代谢组学分析方法对不同条件下培养的集胞藻野生株及其突变株进行分析。
　　为了准确分析光合蓝细菌中的代谢物组，需要对基于LC-MS的代谢组学分析技术中的各个步骤进行优化。本文以光合蓝细菌Synechocystis sp. PCC6803为主要对象，针对性地优化了代谢物萃取步骤、色谱分离条件及质谱参数。优化后的方法可以定性定量检测24种集胞藻中参与中心碳代谢及能量代谢的代谢物，获得了每个代谢物的最适色谱分离条件和质谱参数。
　　对集胞藻野生株和突变株的代谢组学分析显示，在正常培养条件下和丁醇胁迫培养条件下的野生株和缺失sll0039基因的突变株中，基于LC-MS的代谢组学分析中有些代谢物的浓度发生明显变化，例如二磷酸葡萄糖腺苷（ADP-glucose）、5-磷酸核糖（R5P）、二羟丙酮磷酸（DHAP）、6-磷酸葡萄糖（G6P）等。在GC-MS分析中，在不同的培养时间点均发现了与sll0039基因缺失相关的代谢物聚类模块，这说明这些聚类模块中的代谢物与反应调控因子Sll0039的调节相关。
　　另外，在课题组之前的研究工作中发现反应调控因子Slr1037同样参与集胞藻丁醇耐受机制，Δslr1037突变株在丁醇胁迫条件下的生长也受到一定程度的抑制。本文利用代谢组学分析技术比较了Δsll0039突变株和Δslr1037突变株在丁醇胁迫条件下的样品，结果发现两种反应调控因子在集胞藻中的调节机制可能是相互独立的。
　　本文对基于LC-MS的代谢组学分析技术的各个步骤进行了优化，结果证明这一代谢组分析技术可以成功地应用到光合蓝细菌的研究中。同时首次从代谢物水平探究并比较了两个反应调控因子Sll0039和Slr1037在集胞藻对丁醇胁迫条件的耐受机制，提供了完整的代谢组学信息。

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第一章 前言

1.1 生物燃料—生物丁醇的研究现状

1.2 光合蓝细菌生产生物丁醇研究内容

1.3 光合蓝细菌中的双组份信号转导系统

1.4 微生物代谢组学的研究

1.5 本文的主要研究内容

第二章 基于LC-MS的光合蓝细菌代谢组方法优化

2.1实验材料与方法

2.2实验结果与讨论

2.3 小结

第三章 代谢组分析丁醇胁迫条件下集胞藻中sll0039的调控机制

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果与讨论

3.3 小结

第四章 两个对丁醇胁迫条件敏感的反应调控因子突变体间的代谢组学分析比较

4.1 实验材料与方法

4.2 实验结果与讨论

4.3 小结

第五章 结论与展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢

附表