通过启动子工程来组合优化大肠杆菌CO2的转运和固定过程

摘要

琥珀酸的生物合成中，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在PEP羧化酶和PEP羧化激酶的作用下固定CO2生成草酰乙酸是限制性步骤。实验室前期工作基础中，通过过表达外源的CO2转运基因和固定基因，实现了转运与固定的协同代谢调控。为了进一步优化琥珀酸的合成，需要对外源基因进行更为精细的调控。本文首先通过能量矩阵快速构建了启动子文库；然后利用双报告基因对文库进行了特性描述；最后利用文库去组合优化CO2转运基因与固定基因的表达，实现了协同表达体系的优化。
　　首先，构建了启动子文库。本文通过能量矩阵对trc启动子的-10区和-35区进行理性设计，得到了20种不同能量值的启动子。
　　其次，完成了启动子文库的特性描述。本文采用了rfp和cat两个报告基因对文库进行了特性描述。RFU检测结果显示：能量矩阵的方法得到了20种不同强度的启动子，强度分布范围为trc启动子的0.8％-100%。RT-qPCR结果显示：rfp转录水平和翻译水平的相关性达到0.9382，说明基因的表达主要受到转录调控。Cat评估结果显示：两种报告基因所评估的启动子强度类似，相关性达到0.9233，说明文库中的启动子强度是稳定的，具有一定的适用性。因此，启动子文库可以应用于琥珀酸合成途径相关基因表达的协调优化。
　　最后，利用所构建的启动子库实现了CO2转运与固定的协同表达体系的优化。从文库中挑选弱、中、中强、强四种不同强度的启动子(Px)来构建质粒pT-Px-bicA，pT-Px-sbtA，pACYC-Px-pck，pACYC-Px-pck，成功实现了CO2转运基因和固定基因的不同水平的表达。双质粒系统的构建，实现了单转运和单固定的64种组合方式。通过摇瓶发酵的产量初筛和分批补料发酵的产量复筛，得到了3株高产菌株，产量相较于对照组提高了10%以上。对这3株高产菌株进行双转运双固定的组合优化，得到了一株高产菌株Tang1527，产量相较于对照组提高了37.5%，达到89.4 g/L。由此可见，组合优化转运基因和固定基因的表达，有利于提高琥珀酸的产量。
　　本文通过启动子工程来组合优化CO2转运基因和固定基因的表达，最终实现了琥珀酸产量的提高。研究结果为启动子文库的构建及高产琥珀酸工程菌的构建提供了新思路，同时，对代谢途径的组合优化具有一定的借鉴意义。

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第一章 文献综述

1.1琥珀酸

1.1.1琥珀酸的理化性质和用途

1.1.2琥珀酸的合成

1.1.3 CO2对琥珀酸合成的影响

1.2启动子工程

1.2.1启动子的基本结构

1.2.2启动子工程的改造策略及应用

1.2.3启动子工程的发展方向

1.3本论文研究背景和研究内容

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌株与质粒

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1引物设计和基因测序

2.2.2 PCR反应体系

2.2.3琼脂糖凝胶电泳

2.2.4 DNA片段的切胶回收

2.2.5 DNA片段的纯化

2.2.6 DNA片段的酶切

2.2.7 DNA片段的连接

2.2.8大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.9大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.10大肠杆菌质粒的提取

2.2.11红色荧光蛋白的检测

2.2.12大肠杆菌RNA的提取

2.2.13大肠杆菌RNA的反转录

2.2.14 RT-qPCR反应

2.2.15氯霉素抑菌浓度的检测

2.2.16发酵培养

2.2.17菌株生长的测定

2.2.18葡萄糖的测定

2.2.19琥珀酸的检测

2.2.20细胞粗酶液的制备

2.2.21粗酶液中总蛋白的测定

2.2.22酶活的测定

第三章 实验结果与讨论

3.1启动子文库的构建

3.2启动子文库的特性描述

3.2.1以rfp作为报告基因对启动子文库的特性描述

3.2.2以cat作为报告基因对启动子文库的特性描述

3.3启动子文库在琥珀酸合成中的应用

3.3.1双质粒系统的构建

3.3.2单转运单固定的组合方式对琥珀酸产量的影响

3.3.3筛选的单转运单固定组合方式的分批补料发酵

3.3.4优化的双转运双固定组合方式的分批补料发酵

第四章 结论与展望

4.1实验结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢