代谢工程方法改造大肠杆菌生产聚3-羟基丁酸酯

摘要

聚3-羟基丁酸酯（PHB）具有生物可降解性和生物相容性等性能，在医药、食品和农业等领域具有广阔的应用前景。本文研究考查了有氧呼吸链对于PHB积累的影响，构建了一系列生产PHB的菌株；通过引入编码Bacillus subtilis的木糖异构酶基因xylA、木酮糖激酶基因xylB和木糖运输蛋白基因araE，使工程菌株能够同时利用葡萄糖和木糖代谢合成PHB；通过引入木聚糖水解质粒，使工程菌株能够利用木聚糖进行代谢合成PHB，并进一步考察了过表达转醛酶基因talA对利用木聚糖积累PHB的影响。得到的主要结果如下：
　　首先，考查了有氧呼吸链对于PHB积累的影响。采用单基因敲除和组合敲除的策略，敲除Escherichia coliJM109有氧呼吸链中低效率的呼吸链，包括编码细胞色素bd-I氧化酶、细胞色素bd-Ⅰ氧化酶和NDH-Ⅱ脱氢酶的三个基因，分别为cydB、appB和ndh。其中表现优异的三株菌LJ02（ΔappB）、LJ03（Δndh）和LJ23（ΔappBΔndh）利用20 g/L的葡萄糖分别积累了4.53 g/L、6.16 g/L和4.61 g/L PHB，利用20 g/L的木糖分别积累了2.78 g/L、3.50 g/L和1.82 g/LPHB。其中LJ03利用葡萄糖合成PHB的得率为0.32 g(g glucose)-1，是理论得率的66.67％。接着对LJ03进行5-L发酵罐的实验，发酵28 h，积累了28.23 g/L PHB，得率达到了0.25g(gglucose)-1。说明敲除低效率的呼吸链细胞色素bd-I氧化酶和NDH-II脱氢酶对于PHB的积累是有利的。
　　之后通过异源引入编码Bacillus subtilis的木糖异构酶基因 xylA、木酮糖激酶基因 xylB和木糖运输蛋白基因araE，在10 g/L葡萄糖和5 g/L木糖的培养基中，LJ02、LJ03和LJ23能够同时利用葡萄糖和木糖，并且分别积累了3.87 g/L、4.1g/L和4.15g/L PHB。说明解除了E. coli葡萄糖阻遏效应。
　　最后通过引入木聚糖水解质粒，LJ02、LJ03和LJ23利用5 g/L木聚糖和10 g/L木糖，分别积累了2.08g/L、2.02g/L和2.29 g/LPHB。为了提高木糖代谢速率，本研究过表达了转醛酶基因talA，发现过表达talA基因对LJ02和LJ23利用木糖积累PHB是有利的，对LJ03利用木糖积累PHB反而有不利影响。但是过表达talA基因对LJ02、LJ03和LJ23利用木聚糖积累PHB没有提升作用，反而会在一定程度上影响木聚糖的利用。研究结果表明，通过一系列代谢工程改造的E. coliJM109具有良好的PHB合成能力和应用潜力。

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第一章 文献综述

1.1聚羟基脂肪酸酯（PHA）的概述

1.1.1聚羟基脂肪酸酯的组成和分类

1.1.2聚羟基脂肪酸酯的性质和应用前景

1.2聚羟基脂肪酸酯的生物合成

1.2.1由乙酰辅酶A合成PHA的途径

1.2.2由脂肪酸β-氧化途径合成PHA的途径

1.2.3由脂肪酸从头合成途径合成PHA的途径

1.3代谢工程在聚羟基脂肪酸酯生物合成中的应用

1.3.1氧化还原辅因子代谢工程

1.3.2利用非相关碳源合成聚羟基脂肪酸酯

1.4选题背景和研究内容

1.4.1 PHB的国内外研究状况

1.4.2 PHB的应用前景

1.4.3本课题主要研究内容

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌种和质粒

2.1.2主要实验仪器

2.1.3实验药品

2.1.4培养基

2.1.5溶液

2.2实验方法

2.2.1引物设计和基因测序

2.2.2 PCR反应

2.2.3琼脂糖凝胶电泳

2.2.4 DNA片段切胶回收

2.2.5 PCR产物的纯化

2.2.6 DNA的酶切、去磷酸化和连接

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.8 大肠杆菌质粒的提取方法（碱裂解法）

2.2.9大肠杆菌基因组的提取

2.2.10菌株的培养及发酵

2.2.11葡萄糖的测定

2.2.12木聚糖的酸水解

2.2.13 DNS法测定还原糖

2.2.14 RT-PCR

2.2.15大肠杆菌基因的敲除

2.2.16 PHB的检测方法

2.2.17胞内代谢物的提取

第三章 实验结果与讨论

3.1E. coliJM109呼吸链改造

3.1.1 cydB基因敲除

3.1.2 appB基因敲除

3.1.3 ndh基因敲除

3.1.4 组合基因的敲除

3.1.5 工程菌株发酵结果

3.1.6 胞内代谢物的检测

3.2 葡萄糖与木糖共利用合成PHB

3.2.1 异源基因xylA、xylB和araE的引入

3.2.2 基因工程菌株的发酵表征

3.3利用木聚糖合成PHB

3.3.1 工程菌株利用木聚糖合成PHB的发酵表征

3.3.2 talA基因的过表达及工程菌株的发酵表征

3.3.3 工程菌株的发酵表征

第四章 结论与展望

4.1 实验结论

4.2 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢