寨卡病毒解旋酶水解机制的研究

摘要

寨卡病毒是一种由蚊虫来进行传播的虫媒病毒。寨卡病毒感染除可以使新生儿产生小头畸形，还能引起格林-巴利综合征，后者作为一种严重的神经系统疾病，可以导致患者瘫痪乃至死亡。但是，当前依旧没有针对寨卡病毒感染的疫苗或有用的治疗措施，寨卡病毒仍对人类公共健康有着重大危害。 寨卡病毒编码的解旋酶蛋白对于病毒本身的增殖和传播起到至关重要的作用。寨卡病毒在复制过程当中，利用解旋酶水解三磷酸核苷（ATP）获取能量，从而得以实现双链核酸的解旋。在这一过程中，ATP水解是一个重要的基本环节。然而我们对这一环节的分子机制知之甚少，这在很大程度上限制了我们对寨卡病毒解旋酶的进一步功能研究以及针对寨卡病毒的合理药物设计。 在本论文中，我们利用结构生物学的手段对寨卡病毒解旋酶进行研究，解析了其水解ATP过程中间态和终态的高分辨率复合物结构，结合之前已经获得的寨卡病毒水解ATP过程激发态复合物结构，我们对寨卡病毒解旋酶水解ATP的分子机制进行了阐释。除此之外，我们还针对这一过程中解旋酶发挥作用的关键氨基酸位点进行突变设计，并展开一系列活性测定实验，发现了水解过程的关键残基。这些结果为后期的药物靶点设计和筛选提供了依据，从而为开发治疗寨卡病毒的特效药物提供了新的途径。

目录

声明

第1章 引言

1.1 寨卡病毒的病原学特征

1.2.1寨卡病毒流行区域

1.2.2寨卡病毒的传播

1.3 寨卡病毒感染的临床表现

1.4 寨卡病毒的诊断、预防和治疗

1.5 寨卡病毒结构的研究进展

1.5.1 寨卡病毒解旋酶的结构研究进展

1.5.2 寨卡病毒其他功能蛋白的结构研究进展

1.6其他病毒的解旋酶研究

1.7 ATP水解机制研究进展

1.7.1SF1 helicase解旋酶的水解机制研究

1.7.2SF2 helicase解旋酶的水解机制研究

1.8 研究内容与意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 cDNA

2.1.2载体

2.1.3 扩增及突变引物

2.1.4 感受态细胞

2.1.5 实验仪器

2.1.6 实验试剂

2.2.1 原核表达载体的构建

2.2.2 蛋白的表达与纯化

2.2.3 目的蛋白ATPase活性的测定

2.2.4 蛋白结晶

2.2.5晶体的衍射、数据收集及结构解析

第3章 寨卡病毒解旋酶水解ATP的复合物结构研究

3.1.1 寨卡病毒解旋酶的重组质粒构建

3.1.2 寨卡病毒解旋酶的表达纯化

3.1.3 寨卡病毒解旋酶水解ATP各状态复合物晶体的筛选和优化

3.1.4 寨卡病毒解旋酶复合物的结构解析

3.2.1 寨卡病毒解旋酶水解中间态复合物的整体结构

3.2.2 水解中间态复合物与母体状态、水解激发态复合物的结构比较

3.3 寨卡病毒解旋酶水解终态复合物的结构分析

第4章 寨卡病毒解旋酶水解ATP的机制

4.1 寨卡病毒解旋酶水解ATP的活性测定

4.2 寨卡病毒解旋酶ATP水解循环

4.3 寨卡病毒解旋酶水解ATP关键氨基酸位点的突变分析

4.4 水解ATP机制的保守性研究

4.4.1 与DENV4解旋酶ATP水解机制的比较

4.4.2 与HCV解旋酶ATP水解机制的比较

4.4.3 与UvrD解旋酶ATP水解机制的比较

第5章 研究结论及意义

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢