宫颈癌相关基因DNA甲基化与遗传分析及临床应用研究

摘要

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在乳腺癌之后，居第二位。全世界每年约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5％。在我国随着医疗卫生事业的发展，宫颈癌死亡率得到了控制，但发生率一直居高不下，且有发病年轻化的趋势，因此对宫颈癌发生机理及新的诊疗方法的研究一直是肿瘤学家研究的热点。 宫颈癌的发生与人们行为因素具有一定关系，但在不同种族、不同地区发病特点不同。本研究通过对151例宫颈癌患者的病历资料进行系统完整分析，发现在我国宫颈癌多发于中老年妇女，但年轻患者发病率也很高，占12.58％，且年轻患者中94.74％达到中晚期，说明年轻患者发病后进展迅速，恶性程度高，所以对宫颈癌的筛查干预应提前到35岁以前。同时本文还对宫颈癌患者发病规律进行了分析，结果表明与对照组相比初次性交年龄早、性伴侣多、吸烟、酗酒等都是宫颈癌发生的危险因素，此外有上皮性肿瘤家族史和毒物接触史的人患宫颈癌的几率明显加大，因此对这些高危人群定时体检、筛查是预防宫颈癌的重要措施。 宫颈癌的发生是遗传因素与环境因素共同作用的结果，其中HPV病毒感染与宫颈癌发生密切相关。为了了解我国宫颈癌病人的HPV感染特点，本研究采用敏感性高、特异性强的实时荧光定量PCR技术，检测了151例宫颈癌患者的HPV感染情况，发现HPV定量检测均达到阳性检测标准，感染阳性率高达100％；与国内外其它研究小组报道不同，都是高危型：HPV混合感染，且以HPV18为主要感染类型的最多，达到39.74％，同时发现以HPV 33感染为主的病例也达到24.50％，高于文献报道的3％左右，以HPV 33为主要感染类型的患者临床分期和组织学分级都高，说明：HPV 33感染与宫颈癌恶性度有关，HPV 33感染增多可能是我国宫颈癌HPV感染的新特点。 抑癌基因失活在细胞癌变中发挥重要作用。FHIT基因是一种抑癌基因，位于3p14.2，被认为具有HPV病毒的整合位点。FHTT基因与宫颈癌的关系以及作用机制目前尚无定论。本研究利用生物信息学方法获得FHIT基因外显子5～10及附近内含子序列，并依此设计引物，采用降式PCR检测外显子5～10的缺失情况，发现患者血浆中外显子5缺失发生率为22.52％(34/151)，外显子6缺失发生率为19.87％(30/151)，外显子7缺失发生率为13.25％(20/151)，外显子8缺失发生率为14.57％(22/151)，外显子9缺失发生率为11.26％(17/151)，外显子10缺失发生率为6.62％(10/151)，与对应宫颈癌组织中检测出来的结果一致。将FHIT基因外显子缺失情况与FHIT蛋白表达情况对应起来发现FHIT基因外显子5、6缺失与FHTT蛋白表达减弱或缺失具有重要关系，只有1例外显子7缺失病例出现FHIT蛋白表达减弱。本研究虽然外显子8～10缺失的病例没有发现对应的FHIT蛋白表达改变，但只有宫颈癌患者发现有它们的缺失，所以外显子8～10缺失与宫颈癌也具有一定相关性，但具体作用机制还有待于进一步研究。总之，FHIT基因外显子缺失是FHIT基因失活，以至宫颈癌发生的重要遗传机制。抑癌基因失活既可以通过遗传学途径，也可以通过基因甲基化等表观遗传学途径。国外有关于宫颈癌患者FHIT基因启动子区甲基化情况的报道，但检出率较低为32％左右，所以不能广泛应用于临床。本研究针对国内外研究方法的缺点，利用生物信息学方法，设计了甲基化特异性引物，并对亚硫酸氢钠修饰后的DNA浓度进行定量，提高了MSP的诊断正确率。通过对FHIT基因5'端启动子区CpG岛甲基化状况分析，发现宫颈癌患者组织中存在FHIT基因高甲基化的现象，检出率高达53.33％，这为以甲基化为指标诊断宫颈癌提供了重要的实验依据。 关于FHIT基因甲基化在宫颈癌发生中是早期事件，还是晚期事件，目前在国际上还存在着争议。本研究发现在临床Ⅰ期和G1级的患者中都有FHIT基因甲基化出现，随着临床分期与组织学分级的增加，FHIT基因甲基化发生的阳性率也在逐渐增加，并与FHIT蛋白表达的减弱或缺失有关，说明FHIT基因启动子区甲基化在宫颈癌的发生中属于早期事件，支持了Wistuba和Butler等人的观点。同时说明FHIT基因启动子区的高甲基化状态是引起宫颈癌发生的表观遗传学因素，它与FHIT基因外显子缺失引起宫颈癌是两种独立的机制，但两者有可能协同起作用。 CDHl基因编码产物E-钙黏素(E-CAD)是重要的细胞与细胞间黏附分子，CDH1基因失活被认为与肿瘤的浸润和转移密切相关，可以作为检测肿瘤侵袭能力的指标。本研究检测了宫颈癌患者CDH1基因启动子区甲基化状态，并与临床分期和组织学分级对应起来，发现随临床分期与组织学分级的增加，CDH1甲基化的检出率也逐渐增加，CDH1基因甲基化状态可以成为评估宫颈癌进展、治疗效果以及预后的指标。肿瘤细胞可以释放DNA进入患者的血浆/血清中，检测患者血浆/血清中肿瘤DNA的状态可作为无创伤性检测肿瘤的指标。目前对于宫颈癌患者血浆中FHIT基因甲基化状态尚无报道。本研究在国际上首次采用MSP的方法分别对血浆和组织中FHIT基因和CDH1基因的5’端启动子区CpG岛的甲基化状况进行比较分析，发现血浆与组织的符合率在FHIT基因为80.0％，在CDH1基因为76.66％，说明以血浆为样本、以基因的甲基化状态为生物学指标，可以对宫颈癌患者进行无创伤性诊断，若联合应用两种基因进行甲基化状态的分析，将进一步提高诊断的正确性。该方法比CLIA法检测肿瘤标志物的特异性强，减少了假阴性的可能。我们相信在不久的将来，以患者的血浆作为样本，以宫颈癌相关基因甲基化状况作为生物学指标的无创伤性早期诊断宫颈癌方法必将在临床上得以广泛的应用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章引言

第一节宫颈癌的研究进展

1.1.1宫颈癌发生的病因

1.1.2宫颈癌的诊断与筛查

1.1.3宫颈癌的治疗

第二节DNA甲基化的研究进展

1.2.1 DNA甲基化的概念及生物学功能

1.2.2 DNA甲基化与肿瘤的发生与治疗

1.2.3 DNA甲基化的检测方法

第三节FHIT基因在宫颈癌发生中的研究进展

1.3.1 FHIT基因的定位与克隆

1.3.2FHIT因的功能

1.3.3 FHIT基因与肿瘤

1.3.4 FHIT基因与宫颈癌发病的关系

1.3.5 FHIT基因在宫颈癌中的突变和检测

1.3.6 FHIT基因与宫颈癌临床病理的关系

1.3.7 FHIT基因畸变与人乳头状瘤病毒感染的关系

1.3.8 FHIT基因甲基化及与宫颈癌的关系

第四节研究目的与选题依据

第二章材料与方法

第一节实验材料

2.1.1宫颈癌患者血液样本及阴道分泌物

2.1.2宫颈癌患者组织样本

2.1.3宫颈癌患者癌旁组织样本

2.1.4宫颈癌患者组织及癌旁组织的病理切片

2.1.5慢性宫颈炎患者组织样本

2.1.6慢性宫颈炎患者血液样本

2.1.7子宫肌瘤患者组织样本

2.1.8子宫肌瘤患者血液样本

2.1.9正常人血液样本及阴道分泌物

第二节实验方法

2.2.1用实时荧光定量PCR的方法检测HPV病毒

2.2.2 FHIT基因外显子缺失的检测

2.2.3 FHIT及CDH1基因5'端启动子区CpG岛甲基化水平的检测

2.2.4用免疫组织化学的方法检测FHIT蛋白的表达情况

2.2.5用化学发光免疫分析的方法检测肿瘤标志物

第三章结果与分析

第一节宫颈癌患者病历资料分析

3.1.1宫颈癌患者组与对照组计数资料的分组统计

3.1.2宫颈癌患者组与对照组计量资料的分组统计

第二节HPV病毒的定量检测

3.2.1 HPV L1通用引物及探针序列

3.2.2宫颈癌患者HPV的定量

3.2.3正常对照组HPV定量

3.2.4统计结果

第三节 FHIT基因外显子缺失的检测

3.3.1 FHIT基因外显子序列的获得

3.3.2 FHIT基因外显子5-10引物的获得

3.3.3 FHIT基因外显子5的检测

3.3.4 FHIT基因外显子6的检测

3.3.5 FHIT基因外显子7的检测

3.3.6 FHIT基因外显子8的检测

3.3.7 FHIT基因外显子9的检测

3.3.8 FHIT基因外显子10的检测

第四节FHIT、CDH1基因5’端启动子区CpG岛甲基化水平的检测

3.4.1 FHIT基因编码序列及其产物

3.4.2 CDH1基因编码序列及其产物

3.4.3FHIT基因结构

3.4.4 CDH1基因结构

3.4.5 FHIT基因MSP引物设计结果与评估

3.4.6 CDH1基因MSP引物设计结果与评估

3.4.7血浆中DNA的提取和电泳检测

3.4.8组织中DNA提取和电泳检测

3.4.9亚硫酸氢钠修饰后DNA模板的质量检测

3.4.10组织中FHIT基因5'端CpG岛甲基化状态

3.4.11血浆中FHIT基因5'端CpG岛甲基化状态

3.4.12血浆中FHIT基因5'端CpG岛甲基化状态与临床分期的关系

3.4.13血浆中FHIT基因5'端CpG岛甲基化状态与组织学分级的关系

3.4.14组织与对应的血浆中FM引物扩增后的测序结果

3.4.15组织中CDH1基因5’端CpG岛甲基化状态

3.4.16血浆中CDH1基因5’端CpG岛甲基化状态

3.4.17血浆中CDH1基因5’端CpG岛甲基化状态与临床分期的关系

3.4.18血浆中CDH1基因5’端CpG岛甲基化状态与组织学分级的关系

3.4.19组织与对应血浆中EM引物扩增后的测序结果

3.4.20宫颈癌患者两种基因甲基化检测数据

第五节FHIT蛋白表达情况的检测

3.5.1 FHIT蛋白的基本情况

3.5.2宫颈癌组织中FHIT蛋白表达情况

3.5.3 FHIT蛋白表达情况与临床分期的关系

3.5.4 FHIT蛋白表达情况与组织学分级的关系

3.5.5血浆中FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达的关系

3.5.6 FHIT基因外显子缺失与FHIT蛋白表达关系

第六节宫颈癌患者肿瘤标志物的检测

3.6.1正常对照组肿瘤标志物检测

3.6.2宫颈癌患者肿瘤标志物检测

第四章讨论

第一节宫颈癌患者病历资料分析

4.1.1宫颈癌发病的年龄特点

4.1.2与宫颈癌发生相关的因素

第二节宫颈癌相关基因FHIT外显子缺失分析

4.2.1选择FHIT基因作为研究对象的依据

4.2.2对宫颈癌患者组织中FHIT基因外显子缺失的分析

4.2.3对宫颈癌患者血液中FHIT基因外显子缺失的分析

4.2.4 HPV感染特点分析及与FHIT基因外显子缺失的关系

第三节宫颈癌相关基因DNA甲基化的研究

4.3.1基因启动子区DNA甲基化的检测技术的探讨

4.3.2 FHIT基因启动子区DNA甲基化状态的研究

4.3.3 FHIT基因启动子区DNA甲基化与基因失活的关系

4.3.4 CDH1基因启动子区DNA甲基化状态研究的意义

第四节血浆中检测肿瘤标志物的探讨

4.4.1血浆中检测DNA甲基化水平的应用

4.4.2血浆中FHIT、CDH1基因DNA甲基化的检测

4.4.3以血浆中DNA甲基化水平作为标记与其它肿瘤标志物的比较

第五节本研究在临床上的应用前景

4.5.1宫颈癌相关基因甲基化研究在诊断上的应用前景

4.5.2血浆中检测DNA甲基化的应用前景

4.5.3肿瘤相关基因DNA甲基化研究在治疗上的意义

结论

致谢

参考文献

附录

个人简历